Ультрамикротомия

Ультрамикротомия — это метод разрезания образцов на чрезвычайно тонкие срезы, называемые ультратонкими срезами, которые можно изучать и документировать при различных увеличениях в просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ). Он используется в основном для биологических образцов, но также можно готовить срезы из пластика и мягких металлов. Срезы должны быть очень тонкими, поскольку электроны от 50 до 125 кВ стандартного электронного микроскопа не могут проходить через биологический материал намного толще 150 нм. Для наилучшего разрешения срезы должны быть от 30 до 60 нм. Это примерно эквивалентно разделению человеческого волоса толщиной 0,1 мм на 2000 срезов по его диаметру или разрезанию одного эритроцита на 100 срезов. ^[1]

Ультратонкие срезы образцов разрезаются с помощью специализированного инструмента, называемого «ультрамикротом». Ультрамикротом оснащен либо алмазным ножом для большинства биологических ультратонких срезов, либо стеклянным ножом, часто используемым для начальных срезов. Существует множество других единиц оборудования, задействованных в процессе ультрамикротомии. Перед выбором области образца для ультратонкого среза техник исследует полутонкие или «толстые» срезы в диапазоне от 0,5 до 2 мкм. Эти толстые срезы также известны как обзорные срезы и просматриваются под световым микроскопом, чтобы определить, находится ли правильная область образца в положении для тонкого среза. «Ультратонкие» срезы толщиной от 50 до 100 нм можно просматривать в ПЭМ.

Срезы тканей, полученные ультрамикротомией, сжимаются режущей силой ножа. Кроме того, интерференционная микроскопия поверхности среза блоков показывает, что срезы часто не плоские. При использовании Epon или Vestopal в качестве заливочной среды гребни и впадины обычно не превышают 0,5 мкм в высоту, т. е. в 5–10 раз толще обычных срезов (1).

Из исследуемого образца берется небольшой образец. Образцы могут быть из биологического материала, например, ткани животных или растений, или из неорганического материала, например, камня, металла, магнитной ленты, пластика, пленки и т. д. ^[3] Сначала образец обрезается, чтобы создать поверхность блока размером 1 мм на 1 мм. «Толстые» срезы (1 мкм) берутся для изучения на оптическом микроскопе . Выбирается область для разрезания для ТЭМ, и поверхность блока повторно обрезается до размера не более 0,7 мм на стороне. Грани блока обычно имеют квадратную, трапециевидную, прямоугольную или треугольную форму. Наконец, тонкие срезы режутся стеклянным или алмазным ножом с помощью ультрамикротома , и срезы оставляют плавать на воде, которая удерживается в лодке или корыте. Затем срезы извлекаются с поверхности воды и устанавливаются на медной , никелевой , золотой или другой металлической сетке. Идеальная толщина среза для просвечивающей электронной микроскопии с ускоряющими напряжениями от 50 кВ до 120 кВ составляет около 30–100 нм.

В 1952 году Умберто Фернандес Моран представил криоультрамикротомию, которая является похожей техникой, но выполняется при температуре замерзания от −20 до −150°C. Криоультрамикротомия может использоваться для разрезания ультратонких замороженных биологических образцов. Одним из преимуществ по сравнению с более «традиционным» процессом ультрамикротомии является скорость, поскольку можно заморозить и сделать срез образца за 1–2 часа.

• Helander HF (1969). «Топография поверхности ультрамикротомных срезов». J Ultrastruct Res . 29 : 373–382. doi :10.1016/S0022-5320(69)90060-4. PMID  4903906.