Спектроскопия ядерного магнитного резонанса с тройным резонансом

Эксперименты с тройным резонансом представляют собой набор многомерных экспериментов по ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (ЯМР), которые связывают три типа атомных ядер , чаще всего состоящие из 1 H, 15 N и 13 C. Эти эксперименты часто используются для назначения определенных резонансных сигналов определенным атомам в изотопно-обогащенном белке. Метод был впервые описан в работах Эда Бакса , Мицухико Икуры и Льюиса Кея в 1990 году, [1] [2] и затем к набору экспериментов были добавлены дополнительные эксперименты. Многие из этих экспериментов с тех пор стали стандартным набором экспериментов, используемых для последовательного назначения резонансов ЯМР при определении структуры белка с помощью ЯМР . В настоящее время они являются неотъемлемой частью исследования белков методом ЯМР в растворе, и их также можно использовать в ЯМР в твердом состоянии . [3] [4]

Фон

Существует два основных метода определения структуры белка на атомном уровне. Первый из них — рентгеновская кристаллография , начавшаяся в 1958 году, когда была определена кристаллическая структура миоглобина . Второй метод — ЯМР, начавшаяся в 1980-х годах, когда Курт Вютрих изложил основу для определения структуры белков с помощью ЯМР и решил структуру небольших глобулярных белков. [5] Ранний метод определения структуры белка с помощью ЯМР основывался на протонной гомоядерной ЯМР-спектроскопии, в которой размер белка, который может быть определен, ограничен ~10 кДа. Это ограничение связано с необходимостью присваивать сигналы ЯМР от большого количества ядер в белке — в более крупном белке большее количество ядер приводит к переполнению резонансов, а увеличение размера белка также расширяет сигналы, что затрудняет присвоение резонанса. Эти проблемы можно устранить, используя гетероядерную ЯМР-спектроскопию, которая позволяет редактировать спектр протонов относительно химических сдвигов 15 N и 13 C , а также уменьшает перекрытие резонансов за счет увеличения числа измерений спектра. В 1990 году Эд Бакс и его коллеги разработали технологию тройного резонанса и эксперименты с белками, изотопно мечеными 15 N и 13 C, [1], в результате чего спектры значительно упрощаются, что значительно облегчает процесс назначения резонанса и увеличивает размер белка, который может быть определен с помощью ЯМР.

Эти эксперименты по тройному резонансу используют относительно большие магнитные связи между определенными парами ядер для установления их связности. В частности, связи 1 J NH , 1 J CH , 1 J CC и 1 J CN используются для установления скалярного пути связности между ядрами. Процесс переноса намагниченности происходит посредством нескольких эффективных шагов переноса намагниченности с одной связью, а не одного шага через меньшие и переменные связи 3 J HH . Относительно большой размер и хорошая однородность связей с одной связью позволили разработать эффективные схемы переноса намагниченности, которые эффективно однородны по данному белку, почти независимо от конформации. [3] Эксперименты по тройному резонансу с участием 31 P также могут быть использованы для исследований нуклеиновых кислот. [6]

Серия экспериментов

Последовательное назначение с использованием экспериментов по тройному резонансу
Верхний и нижний рисунки показывают путь переноса намагниченности с атомами, которые появляются как выделенные пики. Средний рисунок показывает, как пики появляются в спектрах, здесь представленных как наложение полос спектров HNCACB и CBCA(CO)NH. Пики от CBCA(CO)NH находятся на графике интенсивности и окрашены в желтый цвет; они идентифицируют резонансы предшествующих Cα и Cβ. HNCACB находится на контурном графике и обычно показывает 4 пика для каждой полосы, по два от остатка и его предшествующего. Красные пики предназначены для Cα, а синие пики для Cβ. Здесь синие пики Cβ треонина и аланина являются отличительными и легко идентифицируемыми, в то время как глицин, в котором отсутствует Cβ, дает только один пик. Однако другие типы остатков могут быть не так легко различимы.

Эти эксперименты обычно называются по ядрам (H, N и C), участвующим в эксперименте. CO относится к карбонильному углероду , в то время как CA и CB относятся к Cα и Cβ соответственно, аналогично HA и HB для Hα и Hβ (см. схему для примеров экспериментов). Ядра в названии упорядочены в той же последовательности, что и в пути переноса намагниченности, те ядра, которые помещены в скобки, участвуют в пути переноса намагниченности, но не регистрируются. Из соображений чувствительности эти эксперименты обычно начинаются на протоне и заканчиваются на протоне, как правило, через шаги INEPT и обратного INEPT. Поэтому многие из этих экспериментов являются тем, что можно назвать экспериментами «туда и обратно», где, хотя это и не указано в названии, намагниченность передается обратно исходному протону для получения сигнала.

Некоторые эксперименты используются в тандеме для резонансного назначения белка, например, HNCACB может использоваться вместе с CBCA(CO)NH в качестве пары экспериментов. Не все эти эксперименты нужно записывать для последовательного назначения (это можно сделать всего с двумя), однако дополнительные пары экспериментов полезны для независимой оценки правильности назначения, и избыточность информации может быть необходима, когда есть неоднозначность в назначениях. Другие эксперименты также необходимы для полного назначения резонансов боковой цепи.

Существуют версии TROSY многих из этих экспериментов для улучшения чувствительности. [7] Эксперименты с тройным резонансом также могут быть использованы в последовательно-специфическом назначении резонанса основной цепи спектров ЯМР с вращением под магическим углом в твердотельном ЯМР . [4] [8]

Было проведено большое количество экспериментов по тройному резонансу ЯМР, и перечисленные ниже эксперименты не претендуют на полноту.

HNCO

Эксперимент обеспечивает связи между амидом остатка с карбонильным углеродом предыдущих остатков. [2] Это самый чувствительный из экспериментов тройного резонанса. Боковые цепи карбоксамидов аспарагина и глутамина также видны в этом эксперименте. Кроме того, гуанидиногруппа аргинина , которая имеет схожую константу связи с карбоксамидной группой, также может появляться в этом спектре. Этот эксперимент иногда используется вместе с HN(CA)CO .

HN(CA)CO

Здесь амидный резонанс остатка коррелирует с карбонильным углеродом того же остатка, а также с углеродом предыдущего остатка. Внутриостаточные резонансы обычно сильнее межостаточных. [9]

HN(CO)CA

Этот эксперимент коррелирует резонансы амида остатка с Cα предыдущего остатка. Этот эксперимент часто используется вместе с HNCA. [10]

HNCA

Этот эксперимент коррелирует химический сдвиг амида остатка Cα того же остатка, а также предыдущего остатка. [2] Каждая полоса дает два пика, меж- и внутриостаточный пик Cα. Пик предыдущего Cα может быть идентифицирован из эксперимента HN(CO)CA, который дает только межостаточный Cα.

CBCA(CO)NH

CBCA(CO)NH или, альтернативно, HN(CO)CACB, коррелирует резонансы амида остатка с Cα и Cβ предыдущего остатка. [11] Таким образом, для каждого остатка видны два пика, соответствующие Cα и Cβ. Этот эксперимент обычно используется вместе с HNCACB. Карбоксамид боковой цепи глутаминов и аспарагинов также появляется в этом спектре в этом эксперименте. CBCA(CO)NH иногда точнее называют (HBHA)CBCA(CO)NH, поскольку он начинается с алифатических протонов и заканчивается на амидном протоне, и поэтому не является экспериментом «туда-обратно», как HN(CO)CACB.

HNCACB

HNCACB, или альтернативно CBCANH, коррелирует химический сдвиг амида остатка Cα и Cβ того же остатка, а также предыдущего остатка. [12] В каждой полосе могут быть видны четыре пика – 2 от того же остатка и 2 от предыдущего остатка. Пики от предыдущего остатка обычно слабее и могут быть идентифицированы с помощью CBCA(CO)NH. В этом эксперименте пики Cα и Cβ находятся в противофазе, т. е. если Cα появляется как положительный пик, то Cβ будет отрицательным, что делает идентификацию Cα и Cβ простой. Дополнительная информация о Cβ из набора экспериментов CBCA(CO)NH/HNCACB упрощает идентификацию типа остатка, чем HN(CO)CA/HNCA, однако HNCACB является менее чувствительным экспериментом и может быть непригодным для некоторых белков.

Эксперимент CBCANH менее пригоден для более крупных белков, поскольку он более восприимчив к проблеме ширины линии, чем HNCACB.

CBCACO(CA)HA

Этот эксперимент показывает связи между Cα и Cβ с атомами углерода карбонила и Hα в пределах одного остатка. [13] Боковая карбоксильная группа аспартата и глутамата может слабо проявляться в этом спектре.

CC(CO)NH

Этот эксперимент обеспечивает связь между амидом остатка и алифатическими атомами углерода предыдущего остатка. [14]

H(CCO)NH

Этот эксперимент позволяет установить связи между амидом остатка и атомами водорода, присоединенными к алифатическому углероду предыдущего остатка.

HBHA(CO)NH

Этот эксперимент коррелирует амидный резонанс с Hα и Hβ предыдущего остатка. [15]

Последовательное назначение

Пары экспериментов обычно используются для последовательного назначения, например, пара HNCACB и CBCA(CO)NH или HNCA и HNC(CO)CA. Спектры обычно анализируются как полосы пиков, и полосы из пары экспериментов могут быть представлены вместе бок о бок или как наложение двух спектров. В спектрах HNCACB в каждой полосе обычно присутствуют 4 пика, Cα и Cβ одного остатка, а также пики его предыдущего остатка. Пики от предыдущего остатка могут быть идентифицированы из эксперимента CBCA(CO)NH. Поэтому каждая полоса пиков может быть связана со следующей полосой пиков от соседнего остатка, что позволяет последовательно соединять полосы. Тип остатка может быть идентифицирован по химическим сдвигам пиков, некоторые, такие как серин, треонин, глицин и аланин, гораздо легче идентифицировать, чем другие. Затем резонансы могут быть назначены путем сравнения последовательности пиков с аминокислотной последовательностью белка.

Ссылки

  1. ^ ab Ikura M; Kay LE; Bax A (1990). "Новый подход к последовательному назначению спектров 1 H, 13 C и 15 N белков: гетероядерная трехмерная резонансная ЯМР-спектроскопия. Применение к кальмодулину". Biochemistry . 29 (19): 4659–67. doi :10.1021/bi00471a022. PMID  2372549.
  2. ^ abc Льюис Э. Кей; Мицухико Икура; Рольф Чудин, Эд Бакс (1990). «Трехмерная спектроскопия ЯМР с тройным резонансом изотопно-обогащенных белков». Журнал магнитного резонанса . 89 (3): 496–514. Bibcode : 1990JMagR..89..496K. doi : 10.1016/0022-2364(90)90333-5.
  3. ^ ab Ad Bax (2011). «Тройной резонансный трехмерный белковый ЯМР: до того, как он стал черным ящиком». Журнал магнитного резонанса . 213 (2): 442–5. Bibcode : 2011JMagR.213..442B. doi : 10.1016/j.jmr.2011.08.003. PMC 3235243. PMID  21885307 . 
  4. ^ ab Yongchao Su; Loren Andreas & Robert G. Griffin (2015). "Magic Angle Spinning NMR of Proteins: High-Frequency Dynamic Nuclear Polarization and 1H Detection". Annual Review of Biochemistry . 84 : 485–497. doi : 10.1146/annurev-biochem-060614-034206. PMID  25839340. – через Annual Reviews (требуется подписка)
  5. ^ Курт Вютрих (2001). «Путь к ЯМР-структурам белков». Nature Structural Biology . 8 (11): 923–925. doi :10.1038/nsb1101-923. PMID  11685234. S2CID  26153265.
  6. ^ Габриэль Варани; Фарид Абул-Эла; Фредерик Аллен и Чарльз К. Губсер (1995). «Новые трехмерные эксперименты по тройному резонансу 1H − 13 C− 31 P для последовательных корреляций остова в нуклеиновых кислотах». Журнал биомолекулярного ЯМР . 5 (3): 315–320. doi :10.1007/BF00211759. PMID  7540446. S2CID  31239207.
  7. ^ Михаэль Зальцманн; Герхард Видер; Константин Первушин; Ганс Сенн и Курт Вюлтрих (1999). "TROSY-type Triple-Resonance Experiments for Sequential NMR Assignments of Large Proteins" (PDF) . Журнал Американского химического общества . 121 (4): 844–848. doi :10.1021/ja9834226.{{cite journal}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )
  8. ^ Барбет-Массин и др. (2014). «Быстрое определение протонов с помощью ЯМР для белков с быстрым вращением под магическим углом». Журнал Американского химического общества . 136 (35): 12489–12497. doi :10.1021/ja507382j. PMC 4156866. PMID  25102442 . 
  9. ^ Роберт Т. Клабб; В. Танабал; Герхард Вагнер (1992). «Постоянная по времени трехмерная схема тройного резонансного импульса для корреляции внутриостаточных 1 H N , 15 N и 13 C′ химических сдвигов в белках, меченных 15 N/ 13 C». Журнал магнитного резонанса . 97 (1): 213–217. Bibcode :1992JMagR..97..213C. doi :10.1016/0022-2364(92)90252-3. hdl : 2027.42/30326 .
  10. ^ Ad Bax & Mitsuhiko Ikura (1991). "Эффективный метод 3D ЯМР для корреляции резонансов протона и амида основной цепи 15 N с α-углеродом предыдущего остатка в однородно обогащенных 15 N/ 13 C белках". Журнал биомолекулярного ЯМР . 1 (1): 99–104. doi :10.1007/BF01874573. PMID  1668719. S2CID  20037190.
  11. ^ Стефан Гржесик, Эд Бакс (1992). «Корреляция амидных резонансов основной цепи и боковой цепи в более крупных белках с помощью множественного ретранслируемого тройного резонанса ЯМР». Журнал Американского химического общества . 114 (16): 6291–6293. doi :10.1021/ja00042a003.
  12. ^ Стефан Гржесик, Эд Бакс (1992). «Эффективный эксперимент по последовательному назначению остова изотопно обогащенных белков среднего размера». Журнал магнитного резонанса . 99 (1): 201–207. Bibcode : 1992JMagR..99..201G. doi : 10.1016/0022-2364(92)90169-8.
  13. ^ Кей, Льюис Э. (1993). «Трехмерный эксперимент ЯМР с усилением градиента импульсного поля для корреляции химических сдвигов 13 Cα/β, 13 C' и 1 Hα в однородно меченных углеродом-13 белках, растворенных в воде». Журнал Американского химического общества . 115 (5): 2055–2058. doi :10.1021/ja00058a072.
  14. ^ S. Grzesiek; J. Anglister; A. Bax (1993). «Корреляция резонансов амидной цепи и алифатической боковой цепи в белках, обогащенных 13C/15N, путем изотропного смешивания намагниченности 13C». Журнал магнитного резонанса, серия B. 101 ( 1): 114–119. Bibcode : 1993JMRB..101..114G. doi : 10.1006/jmrb.1993.1019.
  15. ^ Стефан Гржесик и Эд Бакс (1993). «Определение типа аминокислот в процедуре последовательного назначения однородно 13 C/ 15 N-обогащенных белков». Журнал биомолекулярного ЯМР . 3 (2): 185–204. doi :10.1007/BF00178261. PMID  8477186. S2CID  1324255.
  • Эксперименты по тройному резонансу для белков
  • Введение в эксперименты по трехмерному тройному резонансу
  • ЯМР-спектроскопия белков – практическое руководство
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Тройной_резонанс_ядерный_магнитный_резонанс_спектроскопия&oldid=984079148"