Tcr-seq

TCR-Seq ( секвенирование рецепторов Т-клеток ) — это метод, используемый для идентификации и отслеживания определенных Т-клеток и их клонов. ^[1] TCR-Seq использует уникальную природу рецептора Т-клеток (TCR) в качестве готового молекулярного штрихкода. ^[1] Эта технология может применяться как к технологиям секвенирования отдельных клеток , так и к высокопроизводительным скринингам ^[1]

Т-клетки являются частью адаптивной иммунной системы и играют важную роль в защите организма от чужеродных патогенов . ^[2] Т-клеточные рецепторы (ТКР) представляют собой группу мембранных белков, обнаруженных на поверхности Т-клеток, которые могут связываться с чужеродными антигенами. ^[3] ТКР взаимодействуют с главными комплексами гистосовместимости (МГК) на поверхности клеток для распознавания антигенов . Они представляют собой гетеродимеры, состоящие преимущественно из α- и β-цепей (или реже из δ- и γ-цепей) ^[4] и состоят из вариабельной области и константной области. Вариабельные области производятся посредством процесса, называемого рекомбинацией VDJ , который приводит к уникальным аминокислотным последовательностям для α-, β- и γ-цепей. Результатом является то, что каждый ТКР уникален и распознает определенный антиген ^[4]

Области определения комплементарности (CDR) являются частью TCR и играют важную роль во взаимодействиях TCR-MHC. CDR1 и CDR2 кодируются генами V, тогда как CDR3 образуется из области между генами V и J или между генами D и J (называемой « генами VDJ », когда они упоминаются вместе). ^[4] CDR3 является наиболее вариабельной из CDR и находится в прямом контакте с антигеном. ^{[4] [5]} Таким образом, CDR3 используется в качестве «области штрих-кода» для идентификации уникальных популяций Т-клеток, поскольку крайне маловероятно, что две Т-клетки будут иметь одинаковую последовательность CDR3, если только они не произошли от одной и той же родительской Т-клетки. ^{[4] [5]}

Рекомбинация VDJ производит такое огромное количество уникальных TCR, что многие рецепторы никогда не сталкиваются с антигеном, для которого они лучше всего подходят. Когда в организме присутствует чужеродный антиген, несколько Т-клеток, которые распознают этот антиген, положительно выбираются, так что в организме есть достаточное количество Т-клеток для создания эффективного иммунного ответа. ^[6] Выбранные Т-клетки быстро делятся и дифференцируются в эффекторные Т-клетки посредством процесса, называемого клональной экспансией, ^[7] , который сохраняет последовательность TCR (включая последовательность CDR3), которая изначально распознала антиген ^[8]

TCR-Seq использует уникальную природу TCR, в частности CDR3, как молекулярного штрихкода для отслеживания Т-клеток в ходе различных процессов, таких как дифференциация и пролиферация ^[9] , что может быть использовано для самых разных целей.

Секвенирование TCR может быть выполнено на объединенных популяциях клеток («массовое секвенирование») или отдельных клетках (« секвенирование отдельных клеток »). ^[4] Массовое секвенирование полезно для изучения целых репертуаров TCR — всех TCR в пределах индивидуума или образца — и для проведения сравнений между репертуарами разных индивидуумов. ^[4] Этот метод позволяет секвенировать миллионы клеток в одном эксперименте. ^[5] Однако одним из основных недостатков является то, что массовое секвенирование не может определить, какие цепи TCR соединяются вместе, а только частоту в пределах репертуара. Большое количество отобранных TCR также означает, что TCR с меньшим количеством могут быть не обнаружены. ^[5] Секвенирование отдельных клеток может определять пары цепей TCR, что делает их более полезными для идентификации конкретных TCR. ^{[4] [5]} Некоторые основные недостатки этого метода — его высокая стоимость, ^[4] ограниченная емкость в несколько тысяч клеток, ^[5] и необходимость живых клеток, которые может быть сложнее получить ^[4]

Любая цепь TCR может быть секвенирована, хотя цепи α и β чаще выбираются из-за их распространенности в популяции Т-клеток. ^[4] В частности, цепь β представляет интерес из-за ее большего разнообразия и специфичности по сравнению с другими цепями. Наличие компонента гена D в цепи β, который отсутствует в цепи α, позволяет создавать более разнообразные комбинации. ^{[4] [10]} Кроме того, цепи β уникальны для каждой Т-клетки, что может быть использовано для идентификации различных популяций Т-клеток в пределах образца ^{[4] [5] [10]}

Для выполнения секвенирования TCR выполняется амплификация полимеразной цепной реакции (ПЦР) на участке CDR3 как мера уникальных Т-клеток в популяции. ^{[4] [10]} Участок CDR3 выбран вместо CDR1 и CDR2, поскольку он напрямую отвечает за взаимодействие антигенов ^{[4] [10]} и, как правило, уникален для TCR из одной линии, что позволяет идентифицировать различные популяции ^[10]

Цель этого шага — создать библиотеку транскриптов для секвенирования. Существует 3 основных способа создания библиотеки для секвенирования TCR.

Мультиплексная ПЦР может применяться как к геномной ДНК (гДНК) , так и к РНК , преобразованной в двухцепочечную комплементарную ДНК (кДНК) . ^[4] Пулы праймеров с парами праймеров, нацеленными на аллели J и V, используются для амплификации области CDR3 транскрипта TCR. ^{[4] [10]} Транскрипт проходит через два или более раундов ПЦР для амплификации интересующей области, затем адаптеры лигируются на любой конец полученного транскрипта. ^[10] Этот метод является одним из наиболее используемых при создании библиотек для TCR-seq, поскольку он может охватить большую часть разнообразия TCR через пул праймеров. ^{[4] [10]} Однако, поскольку практически невозможно оптимизировать условия ПЦР для всех праймеров в пуле, мультиплексная ДНК может привести к смещению амплификации, когда некоторые области CDR3 с праймерами, которые плохо связываются, могут не амплифицироваться. ^{[5] [10]} Это означает, что обилие амплифицированных сегментов может не соответствовать фактическому обилию внутри клетки ^{[5] [10]}

Этот метод может использовать геномную ДНК или РНК, преобразованную в кДНК. ^{[4] [10]} Исходный материал сначала обрабатывается для получения транскриптов ДНК или кДНК с индексированными адаптерами на 5' и 3' концах. ^[4] Затем эти транскрипты инкубируются с РНК-приманками, предназначенными для связывания с интересующими областями, которыми обычно является область CDR3. ^[4] Эти приманки, которые обычно связаны с магнитными шариками, можно изолировать с помощью магнита. Это позволяет изолировать транскрипты области CDR3, которые затем можно амплифицировать с помощью ПЦР. ^[4] Обогащение мишени с использованием РНК-приманок требует меньшего количества этапов амплификации ПЦР, что может снизить смещение амплификации. ^[4] Однако эффективность захвата магнитами может повлиять на разнообразие амплифицированных транскриптов.

Быстрая амплификация концов кДНК (RACE) — это метод, который использует РНК-транскрипты для создания библиотеки. ^{[4] [10] [11]} Хотя RACE можно применять с 3'- или 5'-концом, 5'-конец чаще используется для TCR-seq. ^[4] Этот метод вращается вокруг добавления общей 5'-адаптерной последовательности к транскрипту, что может быть сделано несколькими различными способами. ^{[11] [12]} Один из методов заключается в добавлении адаптера после обратной транскрипции . Во время создания обратной цепи ДНК из шаблона РНК прямой праймер добавляет последовательность, комплементарную 5'-адаптеру, что приводит к переключению шаблона ^{[4] [10] [11]} Это позволяет включить 5'-адаптер в кДНК при создании комплементарной последовательности. ^{[4] [10] [11] [12]} Праймеры могут быть разработаны для амплификации всего региона от адаптера до константного региона, ^{[4] [10] [11]} затем лигирование адаптера может быть выполнено во второй реакции ПЦР. Поскольку все различные транскрипты теперь имеют идентичный адаптер, их можно амплифицировать с помощью одной пары праймеров. Таким образом, этот метод уменьшает смещение амплификации и улучшает способность обнаруживать более необычные популяции TCR с большей уверенностью. ^{[4] [10] [11]} Однако, поскольку уровни транскрипции TCR различаются между клетками, этот метод не может обеспечить точное измерение количества различных типов Т-клеток в образце на основе только уровня транскриптов РНК ^[4]

После создания библиотеки продукты можно секвенировать, как правило, с помощью секвенирования следующего поколения (NGS) . ^{[4] [10] [11]} Важно использовать машины, способные выполнять более длинные считывания и поддерживать качество считывания на 3'-конце, поскольку область CDR3 находится на 3'-конце транскрипта длиной около 500 пар оснований ^[10]

Частота ошибок NGS представляет собой проблему для анализа репертуаров TCR. ^{[4] [10] [11]} Небольшие изменения в TCR могут изменить их специфичность по отношению к антигенам, ^[10] и как таковые могут представлять интерес для исследователей. Однако ошибки в секвенировании могут генерировать незначительные изменения, которые могут быть интерпретированы как низкочастотная, особая популяция TCR, ^[10] что является проблемой при анализе изменений в репертуарах TCR. Были предприняты усилия по установлению пороговых значений для удаления низкообиличности прочтений из анализа, а также по разработке алгоритмов для исправления этих ошибок ^[10]

Как правило, данные, собранные с помощью TCR-seq, используются для сравнения репертуаров TCR, либо между одним и тем же пациентом в разные моменты времени, либо между разными пациентами. ^{[4] [10] [11]} Недавние исследования изучали характеристики здорового репертуара и обнаружили высокую степень вариации уровней и типов β-цепей TCR, хотя подмножество является общим для разных людей. ^[10] Однако еще не было показано, что это разнообразие тесно коррелирует с какими-либо интересующими условиями, такими как уровень инфицирования или вероятность рецидива рака, ^[10] что предполагает необходимость дальнейших исследований.

Клональное расширение Т-клеток позволяет иммунной системе справляться с различными инфекционными заболеваниями с высокой специфичностью. ^[13] Таким образом, понимание изменений, которые происходят в репертуаре Т-клеток после инфицирования, может способствовать ранней диагностике, мониторингу заболеваний и разработке терапевтических средств ^[5]

Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) — это разрушительное заболевание, вызываемое инфекцией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) , которая приводит к гибели Т-клеток CD4+ ^[14] и дисфункциональных Т-клеток CD8+ ^[5] Недавние исследования показали, что увеличение разнообразия TCR может уменьшить разнообразие ВИЧ и ограничить прогрессирование заболевания ^{[5] [15]} Секвенирование TCR также расширит понимание прогрессирования СПИДа и предскажет заболеваемость ^[5] Кроме того, секвенирование репертуара TCR людей с естественной защитой от заражения СПИДом ^[16] может помочь в разработке вакцины для ограничения дальнейшего распространения заболевания ^[5]

Рак — это неконтролируемое размножение злокачественных клеток, которые могут распространяться по всему телу. ^[17] Это вызвано мутациями внутри раковой клетки, что часто приводит к экспрессии мутантных белков, называемых неоантигенами . ^{[5] [17]} Идентификация этих неоантигенов имеет большое терапевтическое преимущество, поскольку их можно использовать для воздействия на раковые клетки, не нанося вреда нормальным клеткам. Поскольку CD8+ T-клетки могут распознавать некоторые неоантигены в своих TCR, секвенирование репертуаров TCR может помочь идентифицировать потенциальные биомаркеры рака . ^[5] В дополнение к идентификации биомаркеров, секвенирование репертуара TCR может также отслеживать изменения в прогрессировании рака, оценивать ответы на иммунотерапию , ^[18] и оценивать микроокружение опухоли на предмет условий, которые могут сделать его допустимым для роста рака ^[5]

• NOMe-seq
• PLAC-Seq