Определение конца РНК, связанного с транс-сплайсингом экзона

Trans-Spliced ​​Exon Coupled RNA End Determination (TEC-RED) — это транскриптомный метод , который, как и SAGE , позволяет осуществлять цифровое обнаружение последовательностей матричной РНК. В отличие от SAGE, обнаружение и очистка транскриптов с 5'-конца матричной РНК требуют наличия транс-сплайсинговой лидерной последовательности.

Фон транс-сплайсинга

Сплайсированные лидерные последовательности — это короткие последовательности некодирующей РНК , не обнаруженные внутри самого гена, которые прикреплены к 5'-концу всех или части мРНК, транскрибируемых в организме. Было обнаружено, что у нескольких видов они отвечают за разделение полицистронных транскриптов на отдельные генные мРНК , а у других — за сплайсинг на моноцистронные транскрипты. [1] Основная роль транссплайсинга на моноцистронных транскриптах в значительной степени неизвестна. [2] Было высказано предположение, что они могут действовать как независимый промотор, который помогает в тканеспецифической экспрессии независимых изоформ белка. [3] Сплайсированные лидеры были обнаружены у трипаносоматид, эвглены , плоских червей, каенорхабдитис . [1] [4] Некоторые виды содержат только одну сплайсированную лидерную последовательность, обнаруженную на всех мРНК. У C. elegans обнаружены две и обозначены как SL1 и SL2 . [5]

Методы TEC-RED

Протокол TEC RED для получения сигнала РНК

Тотальная РНК очищается из интересующего образца. Затем поли-А- информационная РНК очищается от тотальной РНК и затем транслируется в кДНК с использованием реакции обратной транскрипции. кДНК , полученная из мРНК, маркируется с использованием праймеров, гомологичных сплайсированным лидерным последовательностям организма. В девятишаговой реакции ПЦР кДНК одновременно встраиваются в сайт эндонуклеазы рестрикции BpmI (хотя может работать любая эндонуклеаза рестрикции класса IIs) и биотиновую метку, которые присутствуют в праймерах. Затем эти помеченные кДНК расщепляются на 14 п.н. ниже сайта распознавания с использованием эндонуклеазы рестрикции BpmI и затупляются ДНК-полимеразой T4. Фрагменты далее очищаются от постороннего материала ДНК с использованием биотиновых меток для связывания их с матрицей стрептавидина. Затем они лигируются с адаптерной ДНК в шести отдельных реакциях, содержащих шесть различных сайтов распознавания эндонуклеазы рестрикции. Эти метки затем амплифицируются с помощью ПЦР с праймерами, содержащими несоответствие, изменяющее сайт Bpm1 на сайт Xho1. Ампликоны объединяются и лигируются в плазмидный вектор . Затем клонированные векторы секвенируются и картируются в геноме. [6]

Конкатенация

Различия в конкатенации между TEC RED и SAGE

Конкатенация тегов, разработанная в 2004 году, отличается от той, что наблюдается в SAGE. Расщепление тегов с помощью Xho1 и смешивание различных образцов с последующим лигированием образуют первый шаг конкатенации. Второй шаг использует одну из эндонуклеаз рестрикции с консенсусом к молекуле адаптера, прикрепленной к 3'-концу. Они снова лигируются, и проводится ПЦР для очистки образцов для следующего соединения. Конкатенация продолжается со второй эндонуклеазой рестрикции, затем с третьей и, наконец, с четвертой. Это приводит к конкатемеру, образованному шестью лигированиями эндонуклеаз, содержащему 32 тега, расположенных 5' к 5' вокруг сайта Xho1. [6] В SAGE конкатенация происходит после того, как дитаги сформированы и амплифицированы с помощью ПЦР. Линкеры на внешней стороне дитагов расщепляются ферментом, который обеспечивает их связывание, и эти липкие концы дитагов соединяются случайным образом и помещаются в вектор клонирования. [7]

Преимущества

Преимущество TEC-RED перед SAGE заключается в том, что для начального связывания линкера не требуется эндонуклеаза рестрикции. Это предотвращает смещение, связанное с последовательностями сайтов рестрикции, которые будут отсутствовать в некоторых генах, как это видно в SAGE. Возможность иметь снимок конкретных изоформ РНК позволяет вывести дифференциальную регуляцию изоформ посредством альтернативного выбора промоторов. [8] Это также может помочь в различении паттернов экспрессии, уникальных для последовательности SL1 или SL2. TEC-RED также позволяет характеризовать 5'-концы произведенной РНК и, следовательно, изоформы, которые отличаются аминоконцевым сплайсингом. Технология позволяет определять и проверять все известные и неизвестные гены, которые могут быть предсказаны, а также 5'-изоформы сплайсинга или 5'-концы РНК, которые могут быть произведены. Использование TEC-RED в сочетании с SAGE или модифицированным протоколом позволит различить 5'- и 3'-концы транскриптов соответственно. Таким образом, возможна идентификация альтернативных вариантов сплайсинга и, возможно, относительных количеств, содержащих транс-сплайсинговую лидерную последовательность.

Вариации

Описаны два альтернативных метода, которые позволяют проводить анализ 5'-тега в организмах, не имеющих транс-сплайсированных лидерных последовательностей. Методы, представленные Тошиюки и др. и Шин-ичи и др., называются CAGE и 5' SAGE соответственно. CAGE использует технологию биотинилированного кэп-ловушки для поддержания сигнала мРНК достаточно долго для создания и выбора полноразмерных кДНК , которые имеют адаптерные последовательности, лигированные на 5'-конце. 5' SAGE использует технологию олиго-кэпирования. [9] Оба используют свою адаптерную последовательность для праймирования после создания кДНК . Однако оба этих метода имеют недостатки. CAGE показал, что теги с добавлением гуанина в первой позиции, а олиго-кэпирование может привести к смещению последовательности из-за использования РНК-лигазы. [10]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ ab Riddle, Donald L. (1997). C. elegans II. Плейнвью, Нью-Йорк: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-0-87969-532-3.
  2. ^ Лалл С., Фридман СС, Янковска-Анишка М., Степински Дж., Даржинкевич Э., Дэвис Р. Э. (октябрь 2004 г.). «Вклад транс-сплайсинга, длины 5'-лидера, синергизма кэп-поли(А) и факторов инициации в трансляцию нематод в бесклеточной системе эмбриона Ascaris suum». J. Biol. Chem . 279 (44): 45573– 85. doi : 10.1074/jbc.M407475200 . PMID  15322127.
  3. ^ Choi J, Newman AP (август 2006 г.). «Двухпромоторная система экспрессии генов у C. elegans». Dev. Biol . 296 (2): 537– 44. doi :10.1016/j.ydbio.2006.04.470. PMID  16765937.
  4. ^ Nilsen TW (декабрь 2001 г.). «Эволюционное происхождение транссплайсинга с добавлением SL: все еще загадка». Trends Genet . 17 (12): 678– 80. doi :10.1016/S0168-9525(01)02499-4. PMID  11718904.
  5. ^ Хуан XY, Хирш Д. (ноябрь 1989 г.). «Вторая транс-сплайсированная лидерная последовательность РНК у нематоды Caenorhabditis elegans». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 86 (22): 8640– 4. Bibcode :1989PNAS...86.8640H. doi : 10.1073/pnas.86.22.8640 . PMC 298343 . PMID  2813415. 
  6. ^ ab Hwang BJ, Müller HM, Sternberg PW (февраль 2004 г.). «Аннотация генома с помощью высокопроизводительного определения конца 5' РНК». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 101 (6): 1650– 5. Bibcode :2004PNAS..101.1650H. doi : 10.1073/pnas.0308384100 . PMC 341809 . PMID  14757812. 
  7. ^ Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW (октябрь 1995 г.). «Серийный анализ экспрессии генов». Science . 270 (5235): 484– 7. Bibcode :1995Sci...270..484V. doi :10.1126/science.270.5235.484. PMID  7570003. S2CID  16281846.
  8. ^ Pecci A, Viegas LR, Baranao JL, Beato M (июнь 2001 г.). «Выбор промотора влияет на альтернативный сплайсинг и определяет баланс изоформ, экспрессируемых геном bcl-X мыши». J. Biol. Chem . 276 (24): 21062– 9. doi : 10.1074/jbc.M008665200 . PMID  11274164.
  9. ^ Suzuki Y, Yoshitomo-Nakagawa K, Maruyama K, Suyama A, Sugano S (октябрь 1997 г.). «Конструирование и характеристика библиотеки кДНК с полной длиной и обогащенной 5'-концом». Gene . 200 ( 1– 2): 149– 56. doi :10.1016/S0378-1119(97)00411-3. PMID  9373149.
  10. ^ Harbers M, Carninci P (июль 2005 г.). «Подходы на основе тегов для исследования транскриптома и аннотации генома». Nat. Methods . 2 (7): 495– 502. doi :10.1038/nmeth768. PMID  15973418. S2CID  24186981.
  • Carninci P, Kvam C, Kitamura A и др. (ноябрь 1996 г.). «Высокоэффективное клонирование полноразмерной кДНК с помощью биотинилированного ловушки CAP». Genomics . 37 (3): 327– 36. doi :10.1006/geno.1996.0567. PMID  8938445.
  • Hashimoto S, Suzuki Y, Kasai Y и др. (сентябрь 2004 г.). "5'-end SAGE для анализа сайтов начала транскрипции". Nat. Biotechnol . 22 (9): 1146– 9. doi :10.1038/nbt998. PMID  15300261. S2CID  5485989.
  • Shiraki T, Kondo S, Katayama S и др. (декабрь 2003 г.). «Анализ экспрессии генов с помощью кэпа для высокопроизводительного анализа начальной точки транскрипции и идентификации использования промотора». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 100 (26): 15776– 81. Bibcode :2003PNAS..10015776S. doi : 10.1073/pnas.2136655100 . PMC  307644 . PMID  14663149.
  • Zorio DA, Cheng NN, Blumenthal T, Spieth J (ноябрь 1994 г.). «Опероны как общая форма хромосомной организации у C. elegans». Nature . 372 (6503): 270– 2. Bibcode :1994Natur.372..270Z. doi :10.1038/372270a0. PMID  7969472. S2CID  4257343.
  • Теги CAGE http://genome.gsc.riken.jp/absolute/
  • 5' Результаты SAGE https://archive.today/20040821030224/http://5sage.gi.ku-tokyo.ac.jp/" https://archive.today/20040821030224/http://5sage.gi.ku-tokyo.ac.jp/
  • Теги TEC RED, обнаруженные в базе данных wormbase https://web.archive.org/web/20080909025225/http://www.wormbase.org/db/searches/advanced/dumper
Получено с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Определение_конца_РНК_связанной_транс-сплайсингом_экзона&oldid=1209540924"