клонирование ТА

Клонирование TA (также известное как быстрое клонирование или клонирование T ) — это метод субклонирования , который позволяет избежать использования рестриктаз ^[1] и является более простым и быстрым, чем традиционное субклонирование. Метод основан на способности аденина (A) и тимина (T) (комплементарных пар оснований) на различных фрагментах ДНК гибридизоваться и, в присутствии лигазы , лигироваться вместе. Продукты ПЦР обычно амплифицируются с использованием ДНК-полимеразы Taq , которая предпочтительно добавляет аденин к 3'-концу продукта. Такие амплифицированные ПЦР вставки клонируются в линеаризованные векторы , которые имеют комплементарные 3'- тиминовые выступы. ^[2]

Вставка создается с помощью ПЦР с использованием Taq-полимеразы . Эта полимераза не обладает 3'-5' корректирующей активностью и с высокой вероятностью добавляет один 3'- адениновый выступ к каждому концу продукта ПЦР. Лучше всего, если праймеры ПЦР имеют гуанины на 5'-конце, так как это максимизирует вероятность добавления Taq-ДНК-полимеразой терминального аденозина. ^[3] Термостабильные полимеразы, содержащие обширную 3'-5' экзонуклеазную активность, не следует использовать, так как они не оставляют 3'-адениновых выступов. ^[4]

Целевой вектор линеаризуется и разрезается ферментом рестрикции тупых концов. Затем этот вектор дополняется дидезокситимидинтрифосфатом (ddTTP) с использованием терминальной трансферазы . Важно использовать ddTTP, чтобы гарантировать добавление только одного остатка T. Это дополнение оставляет вектор с одним 3'-выступающим остатком тимина на каждом тупом конце. ^[5] Производители обычно продают «наборы» для клонирования TA с широким спектром подготовленных векторов, которые уже были линеаризованы и помечены выступом тимина.

Учитывая, что нет необходимости в ферментах рестрикции, кроме как для создания линеаризованного вектора, процедура намного проще и быстрее, чем традиционное субклонирование . Также нет необходимости добавлять сайты рестрикции при проектировании праймеров, и, таким образом, можно использовать более короткие праймеры, экономя время и деньги. Кроме того, в случаях, когда нет жизнеспособных сайтов рестрикции, которые можно использовать для традиционного клонирования, в качестве альтернативы часто используется клонирование TA. Основным недостатком клонирования TA является то, что направленное клонирование невозможно, поэтому ген имеет 50% вероятность быть клонированным в обратном направлении. ^[1]

• ТОПО клонирование