Система экспрессии T7

Система экспрессии T7 используется в области микробиологии для клонирования рекомбинантной ДНК с использованием штаммов E. coli . ^[1] Это самая популярная система для экспрессии рекомбинантных белков в E. coli. ^[2]

К 2021 году эта система была описана в более чем 220 000 исследовательских публикациях. ^[3]

Секвенирование и аннотирование генома бактериофага T7 были проведены в 1980-х годах в Брукхейвенской национальной лаборатории Министерства энергетики США под руководством старшего биофизика Ф. Уильяма Штудиера. Вскоре лаборатория смогла клонировать РНК-полимеразу T7 и использовать ее вместе с мощным промотором T7 для транскрипции большого количества практически любого гена. ^[4] Разработка системы экспрессии T7 считается самой успешной биотехнологией, разработанной в Брукхейвенской национальной лаборатории, которая была лицензирована более чем 900 компаниями, что принесло лаборатории более 55 миллионов долларов. ^[5]

Вектор экспрессии, чаще всего вектор экспрессии pET, конструируется для интеграции двух основных компонентов: промотора T7 и интересующего гена ниже промотора и под его контролем. Вектор экспрессии трансформируется в один из нескольких соответствующих штаммов E. coli, чаще всего BL21(DE3). Клетка E. coli также имеет свою собственную хромосому, которая обладает геном, который экспрессируется для производства РНК-полимеразы T7 . (Эта полимераза происходит из фага T7 , вируса бактериофага , который заражает бактериальные клетки E. coli и способен интегрировать свою ДНК в ДНК хозяина, а также переопределять свой клеточный механизм для производства большего количества копий себя.) РНК-полимераза T7 отвечает за начало транскрипции на промоторе T7 трансформированного вектора. Сам ген T7 находится под контролем промотора lac. Обычно и промотор lac, и промотор T7 подавляются в клетке E. coli репрессором Lac . Для того чтобы инициировать транскрипцию, индуктор должен связаться с lac-репрессором и не дать ему ингибировать экспрессию гена T7. Как только это произойдет, ген может нормально транскрибироваться для получения РНК-полимеразы T7. РНК-полимераза T7, в свою очередь, может связаться с промотором T7 на векторе экспрессии и начать транскрибировать свой нижестоящий интересующий ген. Чтобы стимулировать этот процесс, в систему можно добавить индуктор IPTG . IPTG — это реагент, который имитирует структуру аллолактозы и, следовательно, может связываться с lac-репрессором и не давать ему ингибировать экспрессию гена. После добавления достаточного количества IPTG ген T7 нормально транскрибируется, и поэтому также начинается транскрипция интересующего гена нижестоящего от промотора T7. ^[6] Экспрессия рекомбинантного белка под контролем промотора T7 происходит в 8 раз быстрее, чем экспрессия белка под контролем РНК-полимеразы E. coli. ^[7] Базальные уровни экспрессии РНК-полимеразы Т7 в клетке также ингибируются лизоцимом бактериофага Т7, что приводит к задержке накопления РНК-полимеразы Т7 до тех пор, пока лизоцимная активность не насытится. ^[8]

Во время пандемии COVID-19 Moderna и Pfizer разработали вакцины мРНК для борьбы с распространением вируса. И Moderna, и Pfizer использовали систему экспрессии T7 для генерации больших количеств мРНК, необходимых для производства вакцин. ^{[9] [4]}