Одиночная молекула FRET

Флуоресцентный резонансный перенос энергии одиночной молекулы (или Фёрстера) (или smFRET ) — это биофизический метод, используемый для измерения расстояний в масштабе 1–10 нанометров в одиночных молекулах , обычно биомолекулах . Это применение FRET, при котором пара донорных и акцепторных флуорофоров возбуждается и обнаруживается на уровне одной молекулы. В отличие от «ансамблевого FRET», который обеспечивает сигнал FRET большого количества молекул, FRET одиночной молекулы способен разрешить сигнал FRET каждой отдельной молекулы. Изменение сигнала smFRET полезно для выявления кинетической информации, которую измерение ансамбля не может предоставить, особенно когда система находится в равновесии без изменения ансамбля/объемного сигнала. Также может наблюдаться гетерогенность среди различных молекул. Этот метод применялся во многих измерениях внутримолекулярной динамики, такой как сворачивание/разворачивание ДНК/РНК/белка и другие конформационные изменения, а также межмолекулярной динамики, такой как реакция, связывание, адсорбция и десорбция, которые особенно полезны в химическом зондировании, биопробах и биосенсорике.

Методология

Схема типичного эксперимента smFRET (A), кривая расстояния FRET. r — среднее расстояние между двумя красителями за время сбора одной точки данных. (B) и временная траектория (C).

Измерения одиночных молекул FRET обычно выполняются на флуоресцентных микроскопах , с использованием либо поверхностно-иммобилизованных, либо свободно диффундирующих молекул. Одиночные пары FRET освещаются с использованием интенсивных источников света, как правило, лазеров , чтобы генерировать достаточные сигналы флуоресценции для обеспечения обнаружения одиночных молекул. Широкопольная многофотонная микроскопия обычно сочетается с флуоресцентным микроскопом полного внутреннего отражения (TIRF) . Это селективно возбуждает пары FRET на поверхности измерительной камеры и отклоняет шум от основной массы образца. В качестве альтернативы, конфокальная микроскопия минимизирует фон, фокусируя флуоресцентный свет на точечном отверстии, чтобы отклонить свет вне фокуса. [1] Конфокальный объем имеет диаметр около 220 нм, и поэтому его необходимо сканировать поперек, если необходимо изображение образца. При конфокальном возбуждении можно проводить измерения гораздо глубже в образце, чем при использовании TIRF. Сигнал флуоресценции обнаруживается либо с помощью сверхчувствительных ПЗС-камер , либо научных CMOS-камер для широкопольной микроскопии или SPAD для конфокальной микроскопии. [2] После того, как интенсивности отдельных молекул в зависимости от времени доступны, эффективность FRET может быть вычислена для каждой пары FRET как функция времени, и, таким образом, можно отслеживать кинетические события в масштабе отдельных молекул и строить гистограммы FRET , показывающие распределение состояний в каждой молекуле. Однако данные из многих пар FRET должны быть записаны и объединены для того, чтобы получить общую информацию об образце [3] или динамической структуре. [4]

Поверхностно-иммобилизованный

В экспериментах с поверхностной иммобилизацией биомолекулы, помеченные флуоресцентными метками, привязываются к поверхности покровного стекла, и получаются изображения флуоресценции (обычно с помощью ПЗС-камер или научных CMOS- камер). [5] Сбор данных с помощью камер позволит получить фильмы образца, которые необходимо обработать для получения интенсивностей отдельных молекул с течением времени. Если используется конфокальный микроскоп с детектором SPAD , поиск молекул сначала выполняется путем сканирования образца. Затем конфокальная точка располагается на молекуле и собирает данные интенсивности во времени напрямую, что делает дрейф образца незначительным, или используется активная обратная связь для отслеживания молекулы.

Преимущество экспериментов с иммобилизацией на поверхности заключается в том, что многие молекулы можно наблюдать параллельно в течение длительного периода времени до фотообесцвечивания (обычно 1-30 с). Это позволяет нам удобно изучать переходы, происходящие в медленных временных масштабах. Недостатком являются дополнительные биохимические модификации, необходимые для связывания молекул с поверхностью, и возмущения, которые поверхность может потенциально оказывать на молекулярную активность. Кроме того, максимальное временное разрешение интенсивностей отдельных молекул ограничено временем захвата камерой (обычно >1 мс).

Свободно распространяющийся

SmFRET также можно использовать для изучения конформаций молекул, свободно диффундирующих в жидком образце. В экспериментах со свободно диффундирующим smFRET (или smFRET на основе диффузии) те же биомолекулы свободно диффундируют в растворе, будучи возбужденными небольшим объемом возбуждения (обычно пятном, ограниченным дифракцией ). Всплески фотонов из-за пересечения пятна возбуждения одиночной молекулой регистрируются с помощью детекторов SPAD . Конфокальное пятно обычно фиксируется в заданном положении (сканирование не происходит, и изображение не получается). Вместо этого флуоресцентные фотоны, испускаемые отдельными молекулами, пересекающими объем возбуждения, регистрируются и накапливаются для построения распределения различных популяций, присутствующих в образце. В зависимости от сложности этого распределения время сбора данных варьируется от ~5 мин до нескольких часов.

Отличительным преимуществом установок, использующих детекторы SPAD, является то, что они не ограничены «частотой кадров» или фиксированным временем интеграции, как при использовании камер. Фактически, в отличие от камер, SPAD производят импульс каждый раз, когда обнаруживается фотон, в то время как для «временной отметки» каждого импульса с разрешением 10-50 нс требуется дополнительная электроника. Высокое временное разрешение конфокальных измерений FRET одиночных молекул позволяет наблюдателям потенциально обнаруживать динамику на временных масштабах всего лишь 10 мкс. Однако обнаружение «медленных» переходов на временных масштабах, превышающих время диффузии (обычно ~1 мс), сложнее, чем в экспериментах с иммобилизованной поверхностью, и, как правило, требует гораздо более длительного сбора данных.

Обычно флуоресцентное излучение как донорного, так и акцепторного флуорофоров обнаруживается двумя независимыми детекторами, а сигнал FRET вычисляется из соотношения интенсивностей в двух каналах. Некоторые конфигурации установок дополнительно разделяют каждый спектральный канал (донор или акцептор) на две ортогональные поляризации (следовательно, требуя 4 детектора) и способны измерять как FRET, так и анизотропию флуоресценции одновременно. В других конфигурациях 3 или 4 спектральных канала собираются одновременно для одновременного измерения нескольких пар FRET. В качестве источников возбуждения могут использоваться как CW, так и импульсные лазеры . При использовании импульсных лазеров подходящее оборудование для сбора данных может измерять время прибытия фотона относительно последнего лазерного импульса с пикосекундным разрешением в так называемом сборе данных с коррелированным по времени подсчетом одиночных фотонов (TCSPC). В этой конфигурации каждый фотон характеризуется макровременем (т.е. грубой временной меткой 10-50 нс) и микровременем (т.е. задержкой относительно последнего лазерного импульса). Последнее может быть использовано для извлечения информации о времени жизни и получения сигнала FRET.

Анализ данных

Типичные данные smFRET двухкрасочной системы представляют собой временные траектории интенсивности флуоресцентного излучения донорного красителя и акцепторного красителя, называемые двумя каналами. В основном для получения излучения двух красителей используются два метода: (1) накопительное измерение использует фиксированное время экспозиции камер для каждого кадра, таких как PMT, APD, EMCCD и CMOS-камера; (2) последовательность времени прибытия одиночных фотонов, измеряемая с помощью детекторов PMT или APD. Принцип заключается в использовании оптических фильтров или дихроичных зеркал для разделения излучений двух красителей и измерения их в двух каналах. Например, в литературе объясняется установка, использующая две половины камеры с зарядовой связью (ПЗС). [6]

Для системы с двумя красителями сигналы испускания затем используются для расчета эффективности FRET между красителями с течением времени. Эффективность FRET — это количество фотонов, испускаемых акцепторным красителем по сравнению с суммой испусканий донора и акцепторного красителя. Временные траектории, полученные в каждом эксперименте, могут содержать сигналы от неполной или неправильной маркировки или даже агрегатов. Чтобы учесть это, многочисленные исследовательские группы разработали сложные инструменты для выбора временного следа на основе нескольких метрик [7] [8] или с использованием глубокой нейронной сети. [9] Обычно возбуждается только донорный краситель, но еще более точную информацию можно получить, если донорный и акцепторный красители возбуждаются попеременно. [10] В схеме с одним возбуждением испускание донорного и акцепторного красителей — это просто количество фотонов, собранных для двух красителей, деленное на эффективность сбора фотонов двух каналов соответственно, которые являются функциями эффективности сбора, эффективности фильтра и оптической эффективности, а также эффективности камеры двух диапазонов длин волн. Эти показатели эффективности можно откалибровать для данной приборной установки.

Ф Р Э Т = я А η А В А я А η А В А + я Д η Д В Д = я А я А + γ я Д {\displaystyle FRET={\frac {\tfrac {I_{A}}{\eta _{A}Q_{A}}}{{\tfrac {I_{A}}{\eta _{A}Q_{A}}}+{\tfrac {I_{D}}{\eta _{D}Q_{D}}}}}={\frac {I_{A}}{{I_{A}}+\gamma {I_{D}}}}}

где FRET — эффективность FRET системы из двух красителей за определенный период времени, а — измеренные количества фотонов акцепторного и донорного каналов соответственно за тот же период времени, а — эффективность сбора фотонов двух каналов, а — квантовый выход двух красителей, а — поправка к различной собственной яркости двух красителей к настройке микроскопа. Таким образом, вычисляет фактическое количество фотонов, испускаемых красителем. Если эффективность сбора фотонов двух каналов одинакова, а фактическое расстояние FRET не интересует, можно установить два = 1, а два квантовых выхода также равными 1, т. е . . я А {\displaystyle I_{A}} я Д {\displaystyle I_{D}} η А {\displaystyle \эта _{A}} η Д {\displaystyle \эта _{D}} В А {\displaystyle Q_{A}} В Д {\displaystyle Q_{D}} γ {\displaystyle \гамма} я / η {\displaystyle I/\эта } η {\displaystyle \эта} γ = 1 {\displaystyle \гамма =1}

(A) Пример временной траектории подсчетов фотонов акцепторного (красный) и донорного (синий) каналов, собранных с временным разрешением 1 мс. (B) Данные были объединены в временное разрешение 10 мс для снижения шума. Вставка показывает временную траекторию smFRET, рассчитанную с помощью уравнения. Большая часть фотоотсчетов имеет большой шум, в котором доминирует зависящий от счета гауссовский шум, а небольшая область фотоотсчетов доминирует пуассоновский шум.

Для данных кумулятивной эмиссии smFRET временные траектории содержат в основном следующую информацию: (1) переходы состояний, (2) шум, (3) размытие камеры (аналог размытия движения ), (4) фотомерцание и фотообесцвечивание красителей. Информация о переходах состояний — это информация, необходимая для типичного измерения. Однако остальные сигналы мешают анализу данных и, таким образом, должны быть учтены.

Список пакетов программного обеспечения можно найти на сайте KinSoftChallenge. [11] Отчет о результатах сравнения этих пакетов программного обеспечения можно найти здесь. [12] [13]

Шум

Шумовой сигнал эмиссии красителя обычно содержит шум считывания камеры, дробовой шум и белый шум , а также шум реальной выборки, каждый из которых следует разному распределению шума из-за разных источников. Шум реальной выборки возникает из-за теплового возмущения системы, которое приводит к расширению расстояния FRET, неравномерному распределению ориентации красителя, изменениям эмиссии красителя, быстрому миганию и кинетике быстрее времени интегрирования. Медленные изменения эмиссии красителя, вероятно, считаются ложноположительными состояниями, которых следует экспериментально избегать, выбирая другие красители. Другие шумы исходят от пути возбуждения и пути обнаружения, особенно от камеры. В конце концов, шум необработанных данных эмиссии представляет собой комбинацию шумов с распределением Пуассона и распределением Гаусса . Шумы в каждом канале иногда (например, для однофотонных детекторов) можно упростить до суммы гауссова шума, зависящего от интенсивности (чем выше счетчик, тем больше шум; это комбинация гауссова и пуассоновского шума с большей амплитудой, которая может быть представлена ​​гауссовой функцией) и пуассоновского фонового шума (независимого от счетчика сигнала). Последний шум доминирует, когда канал находится в состоянии ВЫКЛ или низкой интенсивности (правый рисунок). Шумы можно аппроксимировать как гауссово распределение, особенно при относительно высоких счетчиках сигнала. Затем шумы в двух каналах объединяются в нелинейное уравнение, приведенное выше, для расчета значений FRET. Таким образом, шум на траекториях smFRET очень сложен. Шум асимметричен выше и ниже средних значений FRET, и его величина изменяется по направлению к двум концам (0 и 1) значений FRET из-за изменяющихся неопределенностей каналов A и D. Большую часть шума можно уменьшить, объединив данные (см. рисунок) с потерей разрешения по времени. Пример кодов MATLAB для моделирования траекторий времени smFRET без шума и с шумом см. на GitHub (postFRET) (ссылка на GitHub [14] ).

Размытие изображения на камере

Размытие камеры, смоделированное с помощью примера smFRET с 3 состояниями с использованием симулятора postFRET [14] (две симуляции). Отношение сигнал/шум установлено на уровне около 20 для обеих симуляций. Временное разрешение смоделировано на уровне 1 мс, а затем сгруппировано до 10 мс, времени интегрирования смоделированных экспериментов. Константы скорости симуляции перечислены слева, небольшая часть траектории показана в середине (альтернативные цвета представляют разные молекулы), а гистограмма FRET всех молекул (100) показана справа.

Сигнал размытия камеры возникает из-за дискретной природы измерений. Сигнал излучения имеет несоответствие с реальным сигналом перехода, поскольку один или оба являются стохастическими (случайными). Когда переход состояния происходит между считыванием двух интервалов считывания излучения, сигнал является средним значением двух частей в одном и том же окне измерения, что затем влияет на точность идентификации состояния и, в конечном итоге, на анализ константы скорости. Это менее проблематично, когда частота измерения намного выше скорости перехода, но становится реальной проблемой, когда они приближаются друг к другу (рисунок справа). Чтобы отразить эффект размытия камеры в моделируемых траекториях smFRET, необходимо моделировать данные в более высоком временном разрешении (например, в 10 раз быстрее), чем время сбора данных, а затем объединить данные в конечные траектории. См. GitHub (postFRET) [14] для примера кодов MATLAB для моделирования временных траекторий smFRET с более высоким временным разрешением, а затем объединить его с разрешением времени измерения (временем интегрирования) для моделирования эффекта размытия камеры.

Фотомигание и фотообесцвечивание

Временные траектории также содержат информацию о фотомерцании и фотообесцвечивании двух красителей. Эту информацию необходимо удалить, что создает пробелы во временной траектории, где теряется информация FRET. Информацию о фотомерцании и фотообесцвечивании можно удалить для типичной системы красителей с относительно длинными интервалами фотомерцания и временем жизни фотообесцвечивания, выбранными при измерении. Таким образом, они представляют меньшую проблему для анализа данных. Однако это станет большой проблемой, если используется краситель с короткими интервалами мигания или долгим временем жизни в темном состоянии. Были разработаны специальные химические растворы для смягчения этих двух проблем, такие как растворы поглотителей кислорода или гасители триплетного состояния.

Алгоритмы идентификации состояния

Для анализа данных было разработано несколько методов анализа данных, таких как методы пороговой обработки, методы скрытой марковской модели (HMM) и методы идентификации точек перехода. Методы пороговой обработки просто устанавливают порог между двумя соседними состояниями на траекториях smFRET. Значения FRET выше порога принадлежат одному состоянию, а значения ниже — другому. Этот метод работает для данных с очень высоким отношением сигнал/шум, таким образом, имея различимые состояния FRET. Этот метод интуитивно понятен и имеет долгую историю применения. Пример исходного кода можно найти в программном обеспечении postFRET. [14] HMM основаны на алгоритмах, которые статистически вычисляют функции вероятности каждого назначения состояний, т. е. добавляют штрафы к менее вероятному назначению. Типичные пакеты программного обеспечения с открытым исходным кодом можно найти в сети, например, HaMMy, vbFRET, ebFRET, SMART, SMACKS, MASH-FRET и т. д. [15] [16] [17] Анализ точек перехода или анализ точек изменения (CPA) использует алгоритмы для определения того, когда происходит переход по временной траектории с использованием статистического анализа. Например, CPA, основанный на теории информации Фишера и методе t-критерия Стьюдента (STaSI, с открытым исходным кодом, ссылка на GitHub [18] [19] ), определяет переходы состояний и минимизирует длину описания, выбирая оптимальное количество состояний, т. е. уравновешивая штраф шума и общее количество состояний.

Анализ ставок

Примеры сетей реакций с различным числом состояний smFRET. Константы скорости могут быть равны нулю, когда переходы запрещены между некоторыми состояниями, которые можно измерить в smFRET.

После того, как состояния идентифицированы, их можно использовать для расчета расстояний переноса энергии резонанса Фёрстера и констант скорости перехода между состояниями. Для параллельной матрицы реакций между состояниями константы скорости каждого перехода не могут быть выведены из средних времен жизни каждого перехода, которые фиксируются как обратная сумма констант скорости. Времена жизни переходов из одного состояния во все другие состояния являются «одинаковыми» для одной молекулы. Однако константы скорости можно рассчитать из функций вероятности, числа каждого перехода за общее время состояния, из которого он переходит. [20]

к я ф = Н я ф ∑ ф = 1 ф = н т я ф = Н я ф т я {\displaystyle k_{if}={\frac {N_{if}}{\sum _{f=1}^{f=n}t_{if}}}={\frac {N_{if}}{t_{i}}}}
Пример идентифицированной траектории состояния и гистограмма времени пребывания каждого перехода. Время жизни — это среднее значение всех времен пребывания, которое является обратной величиной суммы всех констант скорости состояния в другие состояния.

где i — начальное состояние, f — конечное состояние перехода, N — количество этих переходов во временных траекториях, n — общее количество состояний, k — константа скорости, t — время каждого состояния до того, как произойдет переход. Например, измеряется 130 секунд (с) временных траекторий smFRET. Общее время пребывания молекулы в состоянии один составляет t 1 = 100 секунд (с), в состоянии два t 2 = 20 с, а в состоянии три t 3 = 10 с. В течение 100 с молекула остается в состоянии один, переходит в состояние два 70 раз и переходит в состояние три 30 раз в конце своего времени пребывания, константа скорости состояния 1 в состояние 2, таким образом, k 12 = 70/100 = 0,7 с −1 , константа скорости состояния 1 в состояние 3 равна k 13 = 30/100 = 0,3 с −1 . Обычно вероятности длин 70-кратного или 30-кратного перехода (времена пребывания) распределены экспоненциально (правый рисунок). Средние времена пребывания двух распределений состояния один, т. е. два времени жизни, τ 12 и τ 13 , оба одинаковы и составляют 1 с для этих двух переходов (правый рисунок). Число переходов N может быть общим числом переходов состояний или подобранной амплитудой экспоненциальной функции затухания накопленной гистограммы времен пребывания состояний. Последнее работает только для хорошо себя ведущих распределений времени пребывания. Система в равновесии, в которой каждое состояние параллельно переходит во все остальные в реакциях первого порядка, является особым случаем для более простого понимания. Когда система не находится в равновесии, это уравнение все еще справедливо, но следует проявлять осторожность при его использовании.

Интерпретация приведенного выше уравнения основана на предположении, что каждая молекула одинакова, эргодической гипотезе . Существование каждого состояния просто представлено его общим временем, которое является его «концентрацией». Таким образом, скорость перехода в любое другое состояние — это число переходов, нормализованных этой концентрацией. Численно, временная концентрация может быть преобразована в числовая концентрация, чтобы имитировать ансамблевое измерение. [20] Поскольку отдельные молекулы такие же, как и все другие молекулы, мы можем предположить, что временная траектория — это случайная комбинация множества молекул, каждая из которых занимает только очень короткий период времени, скажем, 𝛿 t . Таким образом, «концентрация» молекулы в состоянии n равна c n = t n / 𝛿 t . Среди всех этих «молекул», если N nf переходят в состояние f в течение этого времени измерения 𝛿 t , скорость перехода по определению равна r = N nf / 𝛿 t = k nf c n . Таким образом, k nf = N nf / t n .

Можно увидеть, что измерение константы скорости для одной молекулы зависит только от эргодической гипотезы, о которой можно судить, если статистически достаточное количество отдельных молекул измерено и наблюдаются ожидаемые хорошо ведущие себя распределения времени пребывания. Гетерогенность среди отдельных молекул также может наблюдаться, если каждая молекула имеет различимый набор состояний или набор констант скорости.

Снизить уровень неопределенности

Уровень неопределенности анализа скорости можно оценить с помощью нескольких экспериментальных испытаний, анализа бутстреппинга и анализа ошибок подгонки. Неправильное назначение состояний является распространенным источником ошибок во время анализа данных, которое возникает из-за расширения состояний, шума и размытия камеры. Биннинг данных , скользящее среднее и вейвлет-преобразование могут помочь уменьшить эффект расширения состояний и шума, но усилят эффект размытия камеры.

Эффект размытия камеры может быть уменьшен с помощью более высокой частоты дискретизации, что зависит от разработки более чувствительной камеры, специального анализа данных или и того, и другого. Традиционно в HMM точка данных до и после перехода специально назначается для снижения скорости неправильного назначения этих точек данных состояниям между переходом. Однако есть ограничение для работы этого метода. Когда частота перехода приближается к частоте дискретизации, слишком много данных размывается для работы этого метода (см. выше рисунок размытия камеры). Сообщалось, что экспериментальный подход с использованием импульсного лазера частично преодолевает эффект размытия камеры без очень быстрой камеры. [21] Идея состоит в том, чтобы освещать только очень короткий период в каждом цикле сбора камеры, чтобы избежать усреднения сигнала в каждом цикле.

Также сообщалось о двухэтапном методе анализа данных для повышения точности анализа размытых данных камеры. Идея состоит в том, чтобы смоделировать траекторию с помощью метода моделирования Монте-Карло и сравнить ее с экспериментальными данными. При правильных условиях и моделирование, и экспериментальные данные будут содержать одинаковую степень информации о размытии и шума. Эта смоделированная траектория является лучшим ответом, чем необработанные экспериментальные данные, потому что ее истина «известна». Этот метод имеет открытые исходные коды, доступные как postFRET [22] (ссылка на GitHub [14] ) и MASH-FRET. [16] Этот метод также может немного исправить эффект негауссовского шума, который вызывал трудности при точной идентификации состояний с использованием статистических методов.

Текущий анализ данных для smFRET по-прежнему требует большой осторожности и специальной подготовки, поэтому алгоритмы глубокого обучения призваны сыграть свою роль в освобождении рабочей силы при анализе данных.

Преимущества

Сравнение схематических результатов измерения bulk (оранжевый), ensemble FRET (черный) и smFRET для системы с тремя состояниями (1-3). Bulk-измерение усредняет, а ensemble measurement добавляет все состояния, а smFRET разрешает каждое состояние, подсчитывая популяцию молекул в каждом состоянии с течением времени. Кинетическая информация скрыта в bulk-измерении и ensemble-измерении, но может наблюдаться в smFRET-измерении путем анализа переходов между каждым состоянием с течением времени.

SmFRET позволяет проводить более точный анализ гетерогенных популяций и имеет ряд преимуществ по сравнению с ансамблевым FRET.

Одним из преимуществ изучения расстояний в отдельных молекулах является то, что гетерогенные популяции можно изучать более точно с помощью значений, специфичных для каждой молекулы, а не вычисляя среднее значение на основе ансамбля. Это позволяет изучать специфические гомогенные популяции в гетерогенной популяции. Например, если две существующие гомологичные популяции в гетерогенной популяции имеют разные значения FRET, анализ ансамбля FRET даст взвешенное усредненное значение FRET для представления популяции в целом. Таким образом, полученное значение FRET не дает данных о двух отдельных популяциях. Напротив, smFRET сможет различать две популяции и позволит проводить анализ существующих гомологичных популяций. [23]

SmFRET также обеспечивает динамическое временное разрешение отдельной молекулы, что не может быть достигнуто с помощью ансамблевых измерений FRET. Ансамблевой FRET способен обнаруживать хорошо заселенные переходные состояния , которые накапливаются в популяции, но ему не хватает способности характеризовать промежуточные продукты , которые являются короткоживущими и не накапливаются. Этот предел устраняется smFRET, который предлагает прямой способ наблюдения промежуточных продуктов отдельных молекул независимо от накопления. Когда вы наблюдаете достаточно долгое время за молекулой, будут события переходного состояния, которые длятся достаточно долго, чтобы отличить его от шума или расширения других состояний. Таким образом, smFRET демонстрирует способность захватывать переходные субпопуляции в гетерогенной среде. [24]

Кинетическая информация в системе, находящейся в равновесии, теряется на уровне ансамбля, поскольку ни одна из концентраций реагентов и продуктов не изменяется со временем. Однако на уровне отдельных молекул перенос между реагентами и продуктами может происходить с измеримо высокой скоростью и быть сбалансированным со временем стохастически. Таким образом, отслеживание временной траектории конкретной молекулы позволяет напрямую измерять константу скорости каждого шага перехода, включая промежуточные продукты, которые скрыты на уровне ансамбля из-за их низких концентраций. Это позволяет использовать smFRET для изучения динамики сворачивания ДНК , РНК и белков . Подобно сворачиванию белков , сворачивание ДНК и РНК проходит через множественные взаимодействия, пути сворачивания и промежуточные продукты, прежде чем достичь своих нативных состояний.

Также показано, что SmFRET использует трехцветную систему лучше, чем ансамбль FRET. Используя два акцепторных флуорофора вместо одного, FRET может наблюдать несколько участков для коррелированных движений и пространственных изменений в любой сложной молекуле. Это показано в исследовании соединения Холлидея . SmFRET с трехцветной системой дает представление о синхронизированных движениях трех спиральных участков соединения и почти полном отсутствии его параллельных состояний. Ансамбль FRET также может использовать трехцветную систему. Однако любые очевидные преимущества перевешиваются требованиями трехцветной системы, включая четкое разделение сигналов флуорофоров. Для четкого различия сигнала перекрытия FRET должны быть небольшими, но это также ослабляет силу FRET. SmFRET корректирует свои ограничения перекрытия, используя полосовые фильтры и дихроичные зеркала , которые усиливают сигнал между двумя акцепторами флуоресценции и решают любые эффекты просачивания. [25]

Приложения

Основным применением smFRET является анализ мельчайших биохимических нюансов, которые облегчают сворачивание белка . В последние годы было разработано несколько методов для исследования взаимодействий отдельных молекул, которые участвуют в сворачивании и разворачивании белка. Методы силового зондирования , использующие атомно-силовую микроскопию и лазерный пинцет , предоставили информацию о стабильности белка. smFRET позволяет исследователям исследовать молекулярные взаимодействия с использованием флуоресценции. Резонансный перенос энергии Форстера (FRET) был впервые применен к отдельным молекулам Ха и др. и применен к сворачиванию белка в работе Хохштрассера, Вайса и др. Преимущество, которое smFRET в целом предоставил для анализа молекулярных взаимодействий, заключается в возможности напрямую проверять взаимодействия отдельных молекул без необходимости усреднения ансамблей данных. В анализе сворачивания белка ансамблевые эксперименты включают проведение измерений нескольких белков , которые находятся в различных состояниях перехода между их свернутым и развернутым состоянием . При усреднении структура белка, которую можно вывести из ансамбля данных, дает только элементарную структурную модель сворачивания белка. Однако истинное понимание сворачивания белка требует расшифровки последовательности структурных событий вдоль путей сворачивания между свернутым и развернутым состояниями. Именно в этой конкретной области исследований smFRET весьма применим.

Исследования FRET вычисляют соответствующие эффективности FRET как результат разрешенного по времени наблюдения событий сворачивания белка . Эти эффективности FRET затем могут быть использованы для вывода расстояний между молекулами как функции времени. Поскольку белок переходит между свернутым и развернутым состояниями, соответствующие расстояния между молекулами могут указывать на последовательность молекулярных взаимодействий, которые приводят к сворачиванию белка. [26]

Другое применение smFRET — динамика сворачивания ДНК и РНК. [27] Обычно два разных местоположения нуклеотида помечаются донорными и акцепторными красителями. Изменение расстояния между двумя местоположениями меняется со временем из-за сворачивания и разворачивания нуклеотида, а также случайной диффузии двух точек с течением времени в каждом окне измерения и между различными окнами. Из-за сложности траектории сворачивания/разворачивания чрезвычайно сложно измерить процесс на уровне ансамбля. Таким образом, smFRET становится ключевым методом в этой области. Помимо проблем анализа данных smFRET, одна проблема заключается в маркировке нескольких интересующих позиций, другая — из-за двухточечной динамики для расчета общих путей сворачивания.

Одиночная молекула FRET также может быть применена для изучения конформационных изменений соответствующих мотивов каналов в определенных каналах . Например, меченые тетрамерные калиевые каналы KirBac были помечены донорными и акцепторными флуорофорами в определенных местах, чтобы понять структурную динамику внутри липидной мембраны , что позволяет им обобщать аналогичную динамику для аналогичных мотивов в других эукариотических каналах Kir или даже катионных каналах в целом. Использование smFRET в этом эксперименте позволяет визуализировать конформационные изменения, которые невозможно увидеть, если просто усреднить макроскопические измерения. Это приведет к ансамблевому анализу, а не к анализу отдельных молекул и конформационных изменений внутри, что позволяет нам обобщать аналогичную динамику для аналогичных мотивов в других эукариотических каналах.

Структурная динамика канала KirBac была тщательно проанализирована как в открытом, так и в закрытом состоянии, в зависимости от присутствия лиганда PIP2 . Часть результатов, основанных на smFRET, продемонстрировала структурную жесткость внеклеточной области. Фильтр селективности и внешняя петля области фильтра селективности были помечены флуорофорами , и наблюдалось конформационное сопряжение. Отдельные траектории smFRET убедительно продемонстрировали эффективность FRET около 0,8 без каких-либо колебаний, независимо от состояния канала. [28]

Недавно одиночная молекулярная FRET была применена для количественного обнаружения целевой ДНК и для различения однонуклеотидного полиморфизма. В отличие от ансамблевого FRET, одиночная молекулярная FRET позволяет в реальном времени отслеживать события связывания мишени. Кроме того, низкий фоновый уровень и высокое отношение сигнал/шум, наблюдаемые с помощью одиночной молекулярной техники FRET, приводят к сверхчувствительности (предел обнаружения в фемтомолярном диапазоне). В наши дни для снижения предела обнаружения используются различные типы шагов усиления сигнала.

Ограничения

Несмотря на приблизительные оценки, ограничением smFRET является сложность получения правильного расстояния, участвующего в передаче энергии. Требование точной оценки расстояния порождает серьезную проблему, поскольку флуоресценция донорных и акцепторных флуорофоров, а также передача энергии зависят от окружающей среды и того, как ориентированы красители, что может варьироваться в зависимости от гибкости того, где связаны флуорофоры. Кроме того, фактическое расстояние данного состояния может быть динамическим, а измеренное значение представляет собой среднее расстояние в пределах временного интервала сбора. Однако эта проблема не особенно актуальна, когда оценка расстояния двух флуорофоров не должна быть определена с точной и абсолютной точностью. [6]

Извлечение кинетической информации из сложной биологической системы со скоростью перехода около нескольких миллисекунд или ниже остается сложной задачей. Текущее временное разрешение таких измерений обычно находится на уровне миллисекунд, а несколько отчетов — на уровне микросекунд. Существует теоретическое ограничение фотофизики красителей. Время жизни возбужденного состояния типичной молекулы органического красителя составляет около 1 наносекунды. Для получения статистической достоверности значений FRET требуются десятки-сотни фотонов, что обеспечивает наилучшее возможное временное разрешение порядка 1 микросекунды. Для достижения этого предела требуется очень сильный свет (плотность мощности порядка 1×10 10 Вт м −2 , 10 7 солнца, обычно достигаемая путем фокусировки лазерного луча с помощью микроскопа), что часто вызывает фотоповреждение органических молекул. Другим ограничением является время жизни фотообесцвечивания красителя, которое является функцией интенсивности света и окислительно-восстановительного стресса окружающей среды. Время жизни фотообесцвечивания типичного органического красителя в типичных экспериментальных условиях (плотность мощности лазера всего несколько солнц) составляет несколько секунд или несколько минут с помощью растворов поглотителей кислорода. Таким образом, кинетические события, длящиеся дольше нескольких минут, трудно исследовать с помощью органических красителей. Вместо органических красителей необходимо использовать другие зонды с более длительным временем жизни, такие как квантовые точки, полимерные точки и полностью неорганические красители.

Ссылки

  1. ^ Moerner WE, Fromm DP (2003-08-01). "Методы флуоресцентной спектроскопии и микроскопии одиночных молекул". Review of Scientific Instruments . 74 (8): 3597– 3619. Bibcode : 2003RScI...74.3597M. doi : 10.1063/1.1589587. ISSN  0034-6748. S2CID  11615310.
  2. ^ Michalet X, Colyer RA, Scalia G, Ingargiola A, Lin R, Millaud JE, Weiss S, Siegmund OH, Tremsin AS, Vallerga JV, Cheng A, Levi M, Aharoni D, Arisaka K, Villa F, Guerrieri F, Panzeri F, Rech I, Gulinatti A, Zappa F, Ghioni M, Cova S (февраль 2013 г.). "Разработка новых детекторов подсчета фотонов для флуоресцентной микроскопии одиночных молекул". Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Серия B, Биологические науки . 368 (1611): 20120035. doi :10.1098/rstb.2012.0035. PMC 3538434. PMID  23267185 . 
  3. ^ Ha T, Enderle T, Ogletree DF, Chemla DS, Selvin PR, Weiss S (июнь 1996 г.). «Исследование взаимодействия между двумя одиночными молекулами: перенос энергии резонанса флуоресценции между одиночным донором и одиночным акцептором». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (13): 6264– 8. Bibcode : 1996PNAS...93.6264H. doi : 10.1073/pnas.93.13.6264 . PMC 39010. PMID  8692803. 
  4. ^ Hellenkamp B, Wortmann P, Kandzia F, Zacharias M, Hugel T (февраль 2017 г.). «Многодоменная структура и коррелированная динамика, определяемая самосогласованными сетями FRET». Nature Methods . 14 (2): 176– 182. doi :10.1038/nmeth.4081. PMC 5289555 . PMID  27918541. 
  5. ^ Кастантин М, Шварц ДК (декабрь 2011 г.). «Связывание редких конформаций ДНК и динамики поверхности с использованием резонансного переноса энергии одиночной молекулы». ACS Nano . 5 (12): 9861– 9. doi :10.1021/nn2035389. PMC 3246573. PMID  21942411 . 
  6. ^ ab Roy R, Hohng S, Ha T (июнь 2008 г.). "Практическое руководство по FRET для одиночных молекул". Nature Methods . 5 (6): 507– 16. doi :10.1038/nmeth.1208. PMC 3769523 . PMID  18511918. 
  7. ^ Preus S, Noer SL, Hildebrandt LL, Gudnason D, Birkedal V (июль 2015 г.). "iSMS: программное обеспечение для микроскопии FRET для одиночных молекул". Nature Methods . 12 (7): 593– 594. doi : 10.1038/nmeth.3435. PMID  26125588. S2CID  30222505.
  8. ^ Juette, Manuel F (февраль 2016 г.). «Визуализация неравновесных молекулярных ансамблей с помощью одиночных молекул в миллисекундном масштабе времени». Nature Methods . 13 (4): 341– 344. doi :10.1038/nmeth.3769. PMC 4814340 . PMID  26878382. 
  9. ^ Томсен Дж., Слетфьердинг МБ., Дженсен СБ., Стелла С., Пол Б., Малле МГ. и др. (ноябрь 2020 г.). «DeepFRET, программное обеспечение для быстрой и автоматизированной классификации данных FRET для отдельных молекул с использованием глубокого обучения». eLife . 9 : e60404. doi : 10.7554/eLife.60404 . PMC 7609065 . PMID  33138911. 
  10. ^ Hellemkamp B, Schmid S, et al. (сентябрь 2018 г.). «Точность и достоверность измерений FRET одной молекулы — многолабораторное сравнительное исследование». Nature Methods . 15 (9): 669– 676. doi :10.1038/s41592-018-0085-0. PMC 6121742 . PMID  30171252. 
  11. ^ "KinSoftChallenge - инструменты".
  12. ^ «Вывод кинетических констант скорости из траекторий FRET одиночных молекул – слепой бенчмарк инструментов кинетического анализа». bioRxiv 10.1101/2021.11.23.469671 . 
  13. ^ Götz M, Barth A, Bohr SS, Börner R, Chen J, Cordes T, Erie DA, Gebhardt C, Hadzic MC, Hamilton GL, Hatzakis NS, Hugel T, Kisley L, Lamb DC, de Lannoy C, Mahn C, Dunukara D, de Ridder D, Sanabria H, Schimpf J, Seidel CA, Sigel RK, Sletfjerding MB, Thomsen J, Vollmar L, Wanninger S, Weninger KR, Xu P, Schmid S (сентябрь 2022 г.). «Слепой бенчмарк инструментов анализа для вывода кинетических констант скорости из траекторий FRET одной молекулы». Nature Communications . 13 (1): 5402. Bibcode : 2022NatCo..13.5402G. doi : 10.1038/s41467-022-33023-3. PMC 9474500. PMID  36104339 . 
  14. ^ abcde "GitHub - nkchenjx/PostFRET: Метод подгонки данных FRET для одной молекулы с двумя шагами для повышения точности". GitHub . 5 ноября 2020 г.
  15. ^ Даниал Дж. С., Гарсия-Саес А. Дж. (октябрь 2017 г.). «Повышение уверенности в визуализации отдельных молекул». Current Opinion in Structural Biology . 46 : 24–30 . doi :10.1016/j.sbi.2017.04.007. PMID  28482279.
  16. ^ ab Börner R, Kowerko D, Hadzic MC, König SL, Ritter M, Sigel RK (2018). "Моделирование экспериментов по флуоресценции отдельных молекул с использованием камеры". PLOS ONE . ​​13 (4): e0195277. Bibcode :2018PLoSO..1395277B. doi : 10.1371/journal.pone.0195277 . PMC 5898730 . PMID  29652886. 
  17. ^ Schmid S, Goetz M, Hugel T (2016). «Анализ одиночных молекул за пределами времени пребывания: демонстрация и оценка в равновесии и вне его». Biophysical Journal . 111 (7): 1375–1384 . arXiv : 1605.08612 . Bibcode : 2016BpJ... 111.1375S . doi : 10.1016/j.bpj.2016.08.023. PMC 5052450. PMID  27705761. 
  18. ^ "Код поиска состояний STaSI FRET от Landes Lab". GitHub. 6 марта 2019 г.
  19. ^ Shuang B, Cooper D, Taylor JN, Kisley L, Chen J, Wang W и др. (сентябрь 2014 г.). «Быстрый пошаговый переход и идентификация состояний (STaSI) для анализа дискретных данных по отдельным молекулам». The Journal of Physical Chemistry Letters . 5 (18): 3157– 3161. doi :10.1021/jz501435p. PMC 4167035 . PMID  25247055. 
  20. ^ ab Chen J, Pyle JR, Sy Piecco KW, Kolomeisky AB, Landes CF (июль 2016 г.). «Двухшаговый метод анализа данных smFRET». Журнал физической химии B. 120 ( 29): 7128– 7132. doi :10.1021/acs.jpcb.6b05697. PMID  27379815.
  21. ^ Николсон ДА, Несбитт ДЖ (2021). «Приближение измерений кинетики одиночных молекул с помощью камеры к пределу получения кадров с помощью стробоскопического smFRET». Журнал физической химии B. 125 ( 23): 6080– 6089. doi : 10.1021/acs.jpcb.1c01036. PMID  34097408. S2CID  235369132.
  22. ^ Chen J, Pyle JR, Sy Piecco KW, Kolomeisky AB, Landes CF (июль 2016 г.). «Двухшаговый метод анализа данных smFRET». Журнал физической химии B. 120 ( 29): 7128– 32. doi :10.1021/acs.jpcb.6b05697. PMID  27379815. S2CID  4782546.
  23. ^ Ha T (сентябрь 2001 г.). "Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночной молекулы". Методы . 25 (1): 78– 86. doi :10.1006/meth.2001.1217. PMID  11558999. S2CID  13893394.
  24. ^ Хинтердорфер П., ван Ойен А., ред. (2009). Справочник по биофизике одиночных молекул (1-е изд.). Дордрехт: Спрингер. ISBN 978-0-387-76497-9.
  25. ^ Hohng S, Joo C, Ha T (август 2004). «Одномолекулярный трехцветный FRET». Biophysical Journal . 87 (2): 1328– 37. Bibcode :2004BpJ....87.1328H. doi :10.1529/biophysj.104.043935. PMC 1304471 . PMID  15298935. 
  26. ^ Schuler B, Eaton WA (февраль 2008 г.). «Изучение фолдинга белков методом FRET с использованием одиночной молекулы». Current Opinion in Structural Biology . 18 (1): 16– 26. doi :10.1016/j.sbi.2007.12.003. PMC 2323684. PMID 18221865  . 
  27. ^ Chen J, Poddar NK, Tauzin LJ, Cooper D, Kolomeisky AB, Landes CF (25 сентября 2014 г.). «Исследования одиночной молекулы FRET динамики разворачивания шпильки ВИЧ TAR–ДНК». The Journal of Physical Chemistry B . 118 (42): 12130– 12139. doi :10.1021/jp507067p. PMC 4207534 . PMID  25254491. 
  28. ^ Wang S, Vafabakhsh R, Borschel WF, Ha T, Nichols CG (январь 2016 г.). «Структурная динамика управления калиевыми каналами, выявленная с помощью FRET с одной молекулой». Nature Structural & Molecular Biology . 23 (1): 31– 36. doi :10.1038/nsmb.3138. PMC 4833211 . PMID  26641713. 
  • Лаборатория Нильса Вальтера, Мичиганский университет
  • Центр анализа отдельных молекул в реальном времени (SMART), Мичиганский университет
  • Лаборатория Ха, Медицинская школа Джонса Хопкинса
  • Лаборатория Бланшара, Корнелльский университет
  • Исследовательская группа Шулера, Цюрихский университет
  • Лаборатория Венингера, Университет штата Северная Каролина
  • Исследовательская группа Капанидиса, Оксфордский университет
  • Исследовательская группа Чжуан, Гарвардский университет
  • Исследовательская группа Шварца, Колорадский университет в Боулдере
  • Исследовательская группа Ландеса, Университет Райса
  • Исследовательская группа Чэня, Университет Огайо
  • Исследовательская группа Ян, Принстонский университет
  • Исследовательская группа Комацудзаки, Университет Хоккайдо
  • Исследовательская группа Вайса, Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе
  • Исследовательская группа Гонсалеса, Колумбийский университет
  • Исследовательская группа Hugel, Фрайбургский университет
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Single-molecule_FRET&oldid=1252484399"