Насыщающий мутагенез

Насыщающий мутагенез , или сайт-насыщающий мутагенез (SSM) , или просто сайт-насыщение — это метод случайного мутагенеза, используемый в белковой инженерии , при котором один кодон или набор кодонов заменяется всеми возможными аминокислотами в позиции. ^[1] Существует множество вариантов метода сайт-насыщения, от парного сайт-насыщения (насыщение двух позиций в каждом мутанте в библиотеке) до сканирующего сайт-насыщения (выполнение сайт-насыщения в каждом сайте в белке, в результате чего получается библиотека размером [20^(количество остатков в белке)], которая содержит все возможные точечные мутанты белка).

Метод

Насыщающий мутагенез обычно достигается с помощью сайт-направленного мутагенеза ПЦР со случайным кодоном в праймерах (например, SeSaM ) ^[2] или с помощью искусственного синтеза генов со смесью нуклеотидов синтеза, используемых в кодонах, которые должны быть рандомизированы. ^[3]

Различные вырожденные кодоны могут использоваться для кодирования наборов аминокислот. ^[1] Поскольку некоторые аминокислоты кодируются большим количеством кодонов, чем другие, точное соотношение аминокислот не может быть равным. Кроме того, обычно используются вырожденные кодоны, которые минимизируют стоп-кодоны (которые, как правило, нежелательны). Следовательно, полностью рандомизированный «NNN» не идеален, и используются альтернативные, более ограниченные вырожденные кодоны. «NNK» и «NNS» имеют преимущество кодирования всех 20 аминокислот, но все равно кодируют стоп-кодон в 3% случаев. Альтернативные кодоны, такие как «NDT», «DBK», полностью избегают стоп-кодонов и кодируют минимальный набор аминокислот, которые все еще охватывают все основные биофизические типы (анионные, катионные, алифатические гидрофобные, ароматические гидрофобные, гидрофильные, малые). ^[1] В случае, если нет ограничения на использование только одного вырожденного кодона, можно значительно уменьшить смещение. ^[4]^[5] Было разработано несколько вычислительных инструментов, позволяющих обеспечить высокий уровень контроля над вырожденными кодонами и соответствующими им аминокислотами. ^[6]^[7]^[8]

Вырожденный кодон	Количество кодонов	Количество аминокислот	Количество остановок	Аминокислоты закодированы
ННН	64	20	3	Все 20
ННК / ННС	32	20	1	Все 20
неразрушающий контроль	12	12	0	RNDCGHILFSYV
БДК	18	12	0	ARCGILMFSTWV
НЗТ	8	8	0	РНДЦГСЙ

Приложения

Насыщающий мутагенез обычно используется для создания вариантов для направленной эволюции . ^[9]^[10]

Смотрите также

Мутагенез с насыщением последовательностей

Ссылки

^ abc Reetz, MT; Carballeira JD (2007). «Итеративный насыщающий мутагенез (ISM) для быстрой направленной эволюции функциональных ферментов». Nature Protocols . 2 (4): 891– 903. doi :10.1038/nprot.2007.72. PMID 17446890. S2CID 37361631.
^ Чжэн, Лэй; Бауманн, Ульрих; Реймонд, Жан-Луи (2004-07-15). "Эффективный одношаговый протокол сайт-направленного и сайт-насыщающего мутагенеза". Nucleic Acids Research . 32 (14): e115. doi :10.1093/nar/gnh110. ISSN 0305-1048. PMC 514394. PMID 15304544 .
^ Reetz, Manfred T.; Prasad, Shreenath; Carballeira, José D.; Gumulya, Yosephine; Bocola, Marco (2010-07-07). «Итеративный насыщающий мутагенез ускоряет лабораторную эволюцию стереоселективности ферментов: строгое сравнение с традиционными методами». Журнал Американского химического общества . 132 (26): 9144– 9152. doi :10.1021/ja1030479. ISSN 0002-7863. PMID 20536132.
^ Килле, Сабрина; Асеведо-Роча, Карлос Г.; Парра, Лорето П.; Чжан, Чжи-Ган; Опперман, Дидерик Дж.; Ритц, Манфред Т.; Асеведо, Хуан Пабло (15.02.2013). «Снижение избыточности кодонов и усилия по скринингу комбинаторных белковых библиотек, созданных с помощью насыщающего мутагенеза». ACS Synthetic Biology . 2 (2): 83– 92. doi :10.1021/sb300037w. PMID 23656371.
^ Tang, Lixia; Wang, Xiong; Ru, Beibei; Sun, Hengfei; Huang, Jian; Gao, Hui (июнь 2014 г.). "MDC-Analyzer: новый инструмент для проектирования вырожденных праймеров для создания интеллектуальных библиотек мутагенеза с непрерывными сайтами". BioTechniques . 56 (6): 301– 302, 304, 306– 308, passim. doi : 10.2144/000114177 . ISSN 1940-9818. PMID 24924390.
^ Halweg-Edwards, Andrea L.; Pines, Gur; Winkler, James D.; Pines, Assaf; Gill, Ryan T. (16 сентября 2016 г.). «Веб-интерфейс для сжатия кодонов». ACS Synthetic Biology . 5 (9): 1021– 1023. doi :10.1021/acssynbio.6b00026. ISSN 2161-5063. PMID 27169595.
^ Энгквист, Мартин КМ; Нильсен, Йенс (2015-04-30). "ANT: Программное обеспечение для генерации и оценки вырожденных кодонов для естественных и расширенных генетических кодов". ACS Synthetic Biology . 4 (8): 935–938 . doi :10.1021/acssynbio.5b00018. PMID 25901796.
^ Келл, Дуглас Б.; Дэй, Филип Дж.; Брейтлинг, Райнер; Грин, Люси; Каррин, Эндрю; Свейнстон, Нил (10 июля 2017 г.). «CodonGenie: оптимизированные инструменты для проектирования неоднозначных кодонов». PeerJ Computer Science . 3 : e120. doi : 10.7717/peerj-cs.120 . ISSN 2376-5992.
^ Чика, Роберт А.; и др. (2005). «Полурациональные подходы к инженерной активности ферментов: объединение преимуществ направленной эволюции и рационального дизайна». Current Opinion in Biotechnology . 16 (4): 378– 384. doi :10.1016/j.copbio.2005.06.004. PMID 15994074.
^ Шиванге, Амол V; Мариенхаген, Ян; Мундхада, Хеманшу; Шенк, Александр; Шванеберг, Ульрих (2009-02-01). «Достижения в создании функционального разнообразия для направленной эволюции белков». Current Opinion in Chemical Biology . Biocatalysis and Biotransformation/Bioinorganic Chemistry. 13 (1): 19– 25. doi :10.1016/j.cbpa.2009.01.019. PMID 19261539.

[:0-1] Reetz, MT; Carballeira JD (2007). «Итеративный насыщающий мутагенез (ISM) для быстрой направленной эволюции функциональных ферментов». Nature Protocols . 2 (4): 891– 903. doi :10.1038/nprot.2007.72. PMID 17446890. S2CID 37361631.

[2] Чжэн, Лэй; Бауманн, Ульрих; Реймонд, Жан-Луи (2004-07-15). "Эффективный одношаговый протокол сайт-направленного и сайт-насыщающего мутагенеза". Nucleic Acids Research . 32 (14): e115. doi :10.1093/nar/gnh110. ISSN 0305-1048. PMC 514394. PMID 15304544 .

[3] Reetz, Manfred T.; Prasad, Shreenath; Carballeira, José D.; Gumulya, Yosephine; Bocola, Marco (2010-07-07). «Итеративный насыщающий мутагенез ускоряет лабораторную эволюцию стереоселективности ферментов: строгое сравнение с традиционными методами». Журнал Американского химического общества . 132 (26): 9144– 9152. doi :10.1021/ja1030479. ISSN 0002-7863. PMID 20536132.

[4] Килле, Сабрина; Асеведо-Роча, Карлос Г.; Парра, Лорето П.; Чжан, Чжи-Ган; Опперман, Дидерик Дж.; Ритц, Манфред Т.; Асеведо, Хуан Пабло (15.02.2013). «Снижение избыточности кодонов и усилия по скринингу комбинаторных белковых библиотек, созданных с помощью насыщающего мутагенеза». ACS Synthetic Biology . 2 (2): 83– 92. doi :10.1021/sb300037w. PMID 23656371.

[5] Tang, Lixia; Wang, Xiong; Ru, Beibei; Sun, Hengfei; Huang, Jian; Gao, Hui (июнь 2014 г.). "MDC-Analyzer: новый инструмент для проектирования вырожденных праймеров для создания интеллектуальных библиотек мутагенеза с непрерывными сайтами". BioTechniques . 56 (6): 301– 302, 304, 306– 308, passim. doi : 10.2144/000114177 . ISSN 1940-9818. PMID 24924390.

[6] Halweg-Edwards, Andrea L.; Pines, Gur; Winkler, James D.; Pines, Assaf; Gill, Ryan T. (16 сентября 2016 г.). «Веб-интерфейс для сжатия кодонов». ACS Synthetic Biology . 5 (9): 1021– 1023. doi :10.1021/acssynbio.6b00026. ISSN 2161-5063. PMID 27169595.

[7] Энгквист, Мартин КМ; Нильсен, Йенс (2015-04-30). "ANT: Программное обеспечение для генерации и оценки вырожденных кодонов для естественных и расширенных генетических кодов". ACS Synthetic Biology . 4 (8): 935–938 . doi :10.1021/acssynbio.5b00018. PMID 25901796.

[8] Келл, Дуглас Б.; Дэй, Филип Дж.; Брейтлинг, Райнер; Грин, Люси; Каррин, Эндрю; Свейнстон, Нил (10 июля 2017 г.). «CodonGenie: оптимизированные инструменты для проектирования неоднозначных кодонов». PeerJ Computer Science . 3 : e120. doi : 10.7717/peerj-cs.120 . ISSN 2376-5992.

[9] Чика, Роберт А.; и др. (2005). «Полурациональные подходы к инженерной активности ферментов: объединение преимуществ направленной эволюции и рационального дизайна». Current Opinion in Biotechnology . 16 (4): 378– 384. doi :10.1016/j.copbio.2005.06.004. PMID 15994074.

[10] Шиванге, Амол V; Мариенхаген, Ян; Мундхада, Хеманшу; Шенк, Александр; Шванеберг, Ульрих (2009-02-01). «Достижения в создании функционального разнообразия для направленной эволюции белков». Current Opinion in Chemical Biology . Biocatalysis and Biotransformation/Bioinorganic Chemistry. 13 (1): 19– 25. doi :10.1016/j.cbpa.2009.01.019. PMID 19261539.