Транскрипция потока
 | Эта статья может быть слишком технической для понимания большинства читателей . ( Апрель 2014 ) |
Анализ транскрипции методом run-off — это анализ в молекулярной биологии , который проводится in vitro для определения положения сайта начала транскрипции (1 пара оснований выше) определенного промотора, а также его точности и скорости транскрипции in vitro . [1] [2] [3]
Транскрипцию run-off можно использовать для количественного измерения эффекта изменения промоторных областей на уровнях транскрипции in vitro, [1] [2] [4]. Однако из-за своей природы in vitro этот анализ не может точно предсказать скорость транскрипции генов, специфичную для клеток, в отличие от анализов in vivo, таких как ядерный run-on. [1] [2]
Для проведения анализа транскрипции методом run-off ген, представляющий интерес, включая промотор , клонируется в плазмиду . [4] Плазмида расщепляется на известном сайте рестриктазы ниже сайта начала транскрипции, так что ожидаемый продукт run-off мРНК можно легко отделить с помощью гель-электрофореза . [1] [2] [4]
ДНК должна быть высокоочищенной перед проведением этого анализа. [1] [2] Для инициации транскрипции к линеаризованной ДНК добавляются радиоактивно меченый UTP , другие нуклеотиды и РНК-полимераза . [1] [2] Транскрипция продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не достигнет конца ДНК, где она просто «сбегает» с ДНК-матрицы, в результате чего получается фрагмент мРНК определенной длины. [1] [2] Затем этот фрагмент можно разделить с помощью гель-электрофореза вместе со стандартами размера и авторадиографировать. [1] [2] [4] Соответствующий размер полосы будет представлять размер мРНК от сайта разрезания рестриктазой до сайта начала транскрипции (+1). [4] Интенсивность полосы будет указывать на количество произведенной мРНК. [4]
Кроме того, его можно использовать для определения того, осуществляется ли транскрипция при определенных условиях (например, в присутствии различных химических веществ). [5]
Ссылки
- ^ abcdefgh Левенштейн, PM; Сонг, CZ; Грин, M (2007). «Использование транскрипции in vitro для зондирования регуляторных функций доменов вирусных белков». Методы и протоколы аденовирусов . Методы в молекулярной медицине. Том 131. С. 15–31 . doi :10.1007/978-1-59745-277-9_2. ISBN 978-1-58829-901-7. PMID 17656772.
- ^ abcdefgh "Run-off Transcription". Молекулярная станция. Архивировано из оригинала 22 апреля 2014 г. Получено 16 апреля 2014 г.
- ^ Lelandais, C; Gutierres, S; Mathieu, C; Vedel, F; Remacle, C; Maréchal-Drouard, L; Brennicke, A; Binder, S; Chétrit, P (1996). «Элемент промотора, активный в транскрипции run-off, контролирует экспрессию двух цистронов генов nad и rps в митохондриях Nicotiana sylvestris». Nucleic Acids Research . 24 (23): 4798– 804. doi :10.1093/nar/24.23.4798. PMC 146301. PMID 8972868 .
- ^ abcdef Эллисон, Лизабет. "Фундаментальная молекулярная биология, глава 11" (PDF) . BlackWell Publishing . Получено 18 апреля 2014 г. .
- ^ Санчес, Альваро; Осборн, Мелиса Л.; Фридман, Ларри Дж.; Кондев, Джейн; Геллес, Джефф (2011). «Механизм репрессии транскрипции на бактериальном промоторе с помощью анализа отдельных молекул». Журнал EMBO . 30 (19): 3940– 3946. doi :10.1038/emboj.2011.273. PMC 3209775. PMID 21829165 .
