Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента

В молекулярной биологии полиморфизм длины фрагментов рестрикции ( ПДРФ ) — это метод, который использует вариации в гомологичных последовательностях ДНК , известных как полиморфизмы , популяции или виды, или для точного определения местоположений генов в последовательности. Термин может относиться к самому полиморфизму, обнаруживаемому через различное расположение сайтов рестриктаз , или к связанной лабораторной технике, с помощью которой такие различия могут быть проиллюстрированы. В анализе ПДРФ образец ДНК расщепляется на фрагменты одним или несколькими рестриктазами , а полученные фрагменты рестрикции затем разделяются с помощью гель-электрофореза в соответствии с их размером.

Анализ RFLP в настоящее время в значительной степени устарел из-за появления недорогих технологий секвенирования ДНК , но это был первый метод профилирования ДНК, достаточно недорогой, чтобы найти широкое применение. Анализ RFLP был важным ранним инструментом в картировании генома , локализации генов генетических нарушений , определении риска заболеваний и тестировании отцовства .

Основная методика обнаружения RFLP включает фрагментацию образца ДНК с применением рестриктазы , которая может селективно расщеплять молекулу ДНК везде, где распознается короткая специфическая последовательность в процессе, известном как рестрикционный гидролиз . Фрагменты ДНК, полученные в результате гидролиза, затем разделяются по длине с помощью процесса, известного как электрофорез в агарозном геле , и переносятся на мембрану с помощью процедуры Саузерн-блоттинга . Гибридизация мембраны с меченым зондом ДНК затем определяет длину фрагментов, которые комплементарны зонду. Говорят, что полиморфизм длины рестрикционного фрагмента происходит, когда длина обнаруженного фрагмента различается между особями, что указывает на неидентичные гомологии последовательностей. Каждая длина фрагмента считается аллелем , независимо от того, содержит ли он фактически кодирующую область или нет, и может использоваться в последующем генетическом анализе.

Существует два распространенных механизма, с помощью которых может изменяться размер конкретного фрагмента рестрикции. На первой схеме небольшой сегмент генома обнаруживается ДНК-зондом (более толстая линия). В аллеле A геном расщепляется рестриктазой в трех соседних сайтах (треугольники), но зондом будет обнаружен только самый правый фрагмент. В аллеле a сайт рестрикции 2 был утрачен мутацией , поэтому теперь зонд обнаруживает более крупный слитый фрагмент, идущий от сайтов 1 до 3. Вторая схема показывает, как эта вариация размера фрагмента будет выглядеть на саузерн-блоте, и как каждый аллель (два на человека) может быть унаследован членами семьи.

На третьей схеме зонд и рестриктазу выбираются для обнаружения области генома, которая включает сегмент тандемного повтора переменного числа (VNTR) (прямоугольники на схематической диаграмме). В аллеле c в VNTR имеется пять повторов, и зонд обнаруживает более длинный фрагмент между двумя сайтами рестрикции. В аллеле d в VNTR имеется только два повтора, поэтому зонд обнаруживает более короткий фрагмент между теми же двумя сайтами рестрикции. Другие генетические процессы, такие как вставки , делеции , транслокации и инверсии , также могут приводить к полиморфизмам. Тесты RFLP требуют гораздо больших образцов ДНК, чем тесты коротких тандемных повторов (STR).

Анализ вариации RFLP в геномах ранее был жизненно важным инструментом в картировании генома и генетическом анализе заболеваний. Если исследователи пытались изначально определить хромосомное расположение конкретного гена заболевания, они бы анализировали ДНК членов семьи, пораженной этим заболеванием, и искали бы аллели RFLP, которые показывают схожий рисунок наследования с рисунком заболевания (см. генетическое сцепление ). После того, как ген заболевания был локализован, анализ RFLP других семей мог бы выявить, кто находится в группе риска по заболеванию или кто, вероятно, является носителем мутантных генов. Тест RFLP используется для идентификации и дифференциации организмов путем анализа уникальных рисунков в геноме. Он также используется для идентификации скорости рекомбинации в локусах между сайтами рестрикции.

Анализ RFLP также лег в основу ранних методов генетической дактилоскопии , полезных для идентификации образцов, полученных с мест преступлений , для определения отцовства и для характеристики генетического разнообразия или закономерностей размножения в популяциях животных.

Однако метод анализа RFLP медленный и громоздкий. Он требует большого количества образца ДНК, а комбинированный процесс маркировки зонда, фрагментации ДНК, электрофореза, блоттинга, гибридизации, промывки и авторадиографии может занять до месяца. Ограниченная версия метода RFLP, в которой использовались олигонуклеотидные зонды , была представлена ​​в 1985 году . ^[1] Результаты проекта « Геном человека» в значительной степени заменили необходимость в картировании RFLP, а идентификация многих однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в этом проекте (а также прямая идентификация многих генов и мутаций заболеваний) заменила необходимость в анализе сцепления заболеваний RFLP (см. Генотипирование SNP ). Анализ аллелей VNTR продолжается, но теперь обычно выполняется методами полимеразной цепной реакции (ПЦР). Например, стандартные протоколы для ДНК-дактилоскопии включают ПЦР-анализ панелей из более чем дюжины VNTR.

RFLP до сих пор используется в селекции с помощью маркеров. Полиморфизм длины концевых рестрикционных фрагментов (TRFLP или иногда T-RFLP) — это метод, изначально разработанный для характеристики бактериальных сообществ в образцах смешанных видов. Этот метод также применялся к другим группам, включая почвенные грибы. TRFLP работает путем ПЦР-амплификации ДНК с использованием пар праймеров, помеченных флуоресцентными метками. Затем продукты ПЦР расщепляются с помощью ферментов RFLP, а полученные паттерны визуализируются с помощью секвенатора ДНК. Результаты анализируются либо путем простого подсчета и сравнения полос или пиков в профиле TRFLP, либо путем сопоставления полос из одного или нескольких запусков TRFLP с базой данных известных видов. Было разработано несколько различных программных инструментов для автоматизации процесса сопоставления полос, сравнения и базирования данных профилей TRFLP. ^[2]

Метод в некоторых аспектах похож на электрофорез в градиенте температуры или денатурирующем градиентном геле (TGGE и DGGE).

Изменения последовательности, непосредственно связанные с RFLP, также можно проанализировать быстрее с помощью ПЦР. Амплификация может быть направлена ​​через измененный сайт рестрикции, а продукты могут быть переварены рестриктазой. Этот метод был назван методом расщепленной амплифицированной полиморфной последовательности (CAPS). В качестве альтернативы амплифицированный сегмент может быть проанализирован с помощью зондов аллель-специфических олигонуклеотидов (ASO), процесс, который часто можно выполнить с помощью простого дот-блота .

• Полиморфизм длины амплифицированного фрагмента (AFLP)
• РАПД
• STR-анализ

• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRFLP.shtml