Бисульфитное секвенирование с уменьшенным представлением

Эта статья может быть слишком технической для понимания большинства читателей . Пожалуйста, помогите улучшить ее, чтобы сделать ее понятной для неспециалистов , не удаляя технические детали. ( Март 2019 ) ( Узнайте, как и когда удалять это сообщение )

Бисульфитное секвенирование с уменьшенным представлением ( RRBS ) является эффективным и высокопроизводительным методом анализа профилей метилирования по всему геному на уровне одного нуклеотида. Он объединяет ферменты рестрикции и бисульфитное секвенирование для обогащения областей генома с высоким содержанием CpG . Из-за высокой стоимости и глубины секвенирования для анализа статуса метилирования во всем геноме, Мейсснер и др. разработали этот метод в 2005 году, чтобы уменьшить количество нуклеотидов, необходимых для секвенирования, до 1% генома. ^[1] Фрагменты, которые составляют уменьшенную версию генома, по-прежнему включают большинство промоторов , а также такие области, как повторяющиеся последовательности , которые трудно профилировать с использованием обычных подходов бисульфитного секвенирования. ^[2]

1. Ферментативное расщепление: во-первых, геномная ДНК расщеплена с использованием нечувствительного к метилированию рестриктазы. Для ферментов важно, чтобы на них не влиял статус метилирования CpG (места в геноме, где цитозин находится рядом с гуанином ), поскольку это позволяет расщепление как метилированных, так и неметилированных областей. Обычно используется MspI. Этот фермент нацелен на последовательности 5'CCGG3' и расщепляет фосфодиэфирные связи выше динуклеотида CpG. При использовании этого конкретного фермента каждый фрагмент имеет CpG на каждом конце. Это расщепление приводит к образованию фрагментов ДНК различных размеров.
2. Ремонт концов и A-хвост: Из-за природы того, как MspI расщепляет двухцепочечную ДНК, эта реакция приводит к образованию цепей с липкими концами . Ремонт концов необходим для заполнения 3'-конца концов цепей. Следующий шаг — добавление дополнительного аденозина как к плюсовой, так и к минусовой цепям . Это называется A-хвостом и необходимо для лигирования адаптера на последующем шаге. Ремонт концов и A-хвост выполняются в тех же реакциях с использованием дезоксирибонуклеотидов dCTP, dGTP и dATP. Чтобы повысить эффективность A-хвоста, в этой реакции dATP добавляются в избытке.
3. Адаптеры последовательностей: метилированные адаптеры последовательностей лигируются с фрагментами ДНК. Метилированные олигонуклеотиды адаптеров имеют все цитозины, замененные на 5'метилцитозины, чтобы предотвратить дезаминирование этих цитозинов в реакции бисульфитной конверсии. Для секвенирования реакций с использованием секвенаторов Illumina адаптеры последовательностей гибридизуются с адаптерами в проточной ячейке.
4. Очистка фрагментов: для очистки выбирается желаемый размер фрагментов. Фрагменты разных размеров разделяются с помощью гель-электрофореза и очищаются с помощью гель-экзирования. Согласно Gu et al., фрагменты ДНК длиной 40-220 пар оснований являются репрезентативными для большинства последовательностей промотора и CpG-островков ^[2]
5. Бисульфитная конверсия: Затем фрагменты ДНК подвергаются бисульфитной конверсии, которая представляет собой процесс, дезаминирующий неметилированный цитозин в урацил . Метилированные цитозины остаются неизменными, поскольку метильная группа защищает их от реакции.
6. ПЦР-амплификация: ДНК, преобразованная бисульфитом, затем амплифицируется с помощью ПЦР с праймерами , которые комплементарны адаптерам последовательностей.
7. Очистка ПЦР: Перед секвенированием продукт ПЦР должен быть свободен от неиспользованных реагентов реакции, таких как невключенные dNTP или соли. Таким образом, требуется этап очистки ПЦР. Это можно сделать, проведя еще один электрофорезный гель или используя наборы, разработанные специально для очистки ПЦР.
8. Секвенирование: Затем фрагменты секвенируются. Когда впервые был разработан RRBS, изначально использовалось секвенирование по Сэнгеру . Теперь используются подходы к секвенированию следующего поколения. Для секвенирования Illumina чаще всего выполняются считывания одноконцевой последовательности из 36 оснований.
9. Выравнивание и анализ последовательностей: Из-за уникальных свойств RRBS для выравнивания и анализа требуется специальное программное обеспечение. ^[3] Использование MspI для расщепления геномной ДНК приводит к фрагментам, которые всегда начинаются с C (если цитозин метилирован) или T (если цитозин не был метилирован и был преобразован в урацил в реакции бисульфитной конверсии). Это приводит к неслучайному составу пар оснований. Кроме того, состав оснований искажен из-за смещенных частот C и T в образцах. Доступно различное программное обеспечение для выравнивания и анализа, такое как Maq, BS Seeker, Bismark или BSMAP. Выравнивание с референтным геномом позволяет программам идентифицировать пары оснований в геноме, которые метилированы.

RRBS уникально использует специфический фермент рестрикции для обогащения CpG. Расщепление MspI или любым ферментом рестрикции, который распознает CpG и разрезает их, производит только фрагменты с CG на конце. ^[2] Этот подход обогащает CpG-регионы генома, поэтому он может уменьшить объем необходимого секвенирования, а также снизить стоимость. ^[2] Этот метод экономически эффективен, особенно при фокусировании на распространенных CpG-регионах.

Для точного анализа данных требуется только низкая концентрация образца, от 10 до 300 нг. ^[2] Этот метод можно использовать при отсутствии ценного образца. Другим положительным аспектом является то, что не требуются свежие или живые образцы. Также можно использовать фиксированные формалином и залитые парафином входные данные. ^[2]

В конкретных шагах протокола также есть некоторые ограничения. MspI-расщепление охватывает большинство, но не все регионы CG в геноме. ^[2] Некоторые CpG пропущены. Пропущенные CpG также могут иметь место, поскольку этот протокол является лишь репрезентативной выборкой генома. ^[2] Таким образом, некоторые регионы имеют более низкий охват. Другие вариации этого протокола используют альтернативные ферменты. ^[4]

Во время ПЦР-части протокола необходимо использовать полимеразу, не выполняющую корректуру, поскольку корректирующий фермент остановится на остатках урацила, обнаруженных в шаблоне одноцепочечной ДНК. ^[1] Использование полимеразы, которая не выполняет корректуру, также может привести к увеличению ошибок ПЦР-секвенирования. ^[1]

Бисульфитное секвенирование преобразует только одноцепочечную ДНК (ssDNA). Полная бисульфитная конверсия требует тщательной денатурации и отсутствия повторно отожженной двухцепочечной ДНК (dsDNA). ^[1] Было показано, что простые шаги протокола обеспечивают полную денатурацию. Обеспечение использования небольших фрагментов посредством сдвига или переваривания, свежих реагентов и достаточного времени денатурации имеет решающее значение для полной денатурации ^[5] Другой предлагаемый метод заключается в проведении бисульфитной реакции при 95 °C, хотя деградация ДНК также происходит при высоких температурах. ^[5] Предполагается, что в течение первого часа бисульфитной реакции менее 90% образца ДНК теряется в результате деградации ^[6] Для обеспечения полной денатурации и снижения деградации ДНК требуется баланс между высокой и низкой температурой. Также можно использовать реагенты, такие как мочевина, которые предотвращают образование dsDNA. ^[5] При загрязнении dsDNA может быть сложно точно вычислить данные. ^[1] Когда наблюдается неконвертированный цитозин, сложно отличить отсутствие метилирования от артефакта. ^[1]

Значимость этого метода заключается в том, что он позволяет секвенировать метилированные области, которые не могут быть правильно профилированы с помощью обычных методов бисульфитного секвенирования. Современные технологии секвенирования ограничены в отношении профилирования областей повторяющихся последовательностей. ^[7] Это досадно в отношении исследований метилирования, поскольку эти повторяющиеся последовательности часто содержат метилированные цитозины. Это особенно ограничивает исследования, включающие профилирование раковых геномов, поскольку потеря метилирования в этих повторяющихся последовательностях наблюдается во многих типах рака. ^[8] RRBS устраняет проблемы, возникающие из-за этих больших областей повторяющихся последовательностей, и, таким образом, позволяет более полно аннотировать эти области.

Аберрантное метилирование наблюдалось при раке. ^[9] При раке в опухолях наблюдалось как гиперметилирование, так и гипометилирование. ^[9] Поскольку RRBS очень чувствителен, этот метод можно использовать для быстрого изучения аберрантного метилирования при раке. ^[10] Если можно получить образцы из опухолевых и нормальных клеток пациента, можно провести сравнение между этими двумя типами клеток. ^{[2] [10]} Профиль общего метилирования можно получить довольно быстро. ^[2] Этот метод позволяет быстро определить общий статус метилирования раковых геномов, что является экономически эффективным и экономит время.

Стадиально-специфические изменения можно наблюдать во всех живых организмах. Изменения в общих уровнях метилирования посредством бисульфитного секвенирования с пониженным представительством могут быть полезны в биологии развития.

Результаты, сравненные между RRBS и MethylC-seq, в высокой степени согласуются друг с другом. ^[11] Естественно, MethylC-seq имеет больший охват CpG по всему геному по сравнению с RRBS, но RRBS имеет больший охват CpG-островков. ^[11] Одним из других наиболее часто используемых методов профилирования метилирования является MeDiP-Seq. Этот метод выполняется путем иммунопреципитации метилированных цитозинов и последующего секвенирования. ^[11] RRBS имеет большее разрешение по сравнению с этим методом, поскольку MeDip-Seq ограничен 150 парами оснований по сравнению с разрешением в один нуклеотид RRBS. ^[11] Бисульфитные методы, такие как используемые RRBS, также оказались более точными, чем основанные на обогащении, такие как MeDip-Seq. ^[7] Данные, полученные по RRBS и метилированию Illumina Infinium, в высокой степени сопоставимы, с корреляцией Пирсона 0,92. ^[7] Данные для обеих платформ также напрямую сопоставимы, поскольку обе используют абсолютное измерение ДНК.

Наконец, группа Бена Делатта в Active Motif разработала секвенирование на основе бисульфита (ABBS). Эта технология использует специализированные праймеры, которые захватывают метилирование ДНК, что позволяет увеличить покрытие (примерно в 10 раз больше, чем WGBS) и снизить затраты на секвенирование. Они также показали, что ABBS не так ограничен, как RRBS, и может использоваться в качестве альтернативы MeDIP-seq, сохраняя разрешение оснований. ^[12]