Рекомбинация

Рекомбинация ( рекомбинационно -опосредованная генная инженерия ) [1] — это метод генетической и молекулярной биологии, основанный на системах гомологичной рекомбинации , в отличие от более старого/более распространенного метода использования рестриктаз и лигаз для объединения последовательностей ДНК в определенном порядке. Рекомбинация широко используется в бактериальной генетике, при создании целевых векторов для создания условного мышиного нокаута и для модификации ДНК любого источника, часто содержащегося на бактериальной искусственной хромосоме (BAC), среди других приложений.

Разработка

Хотя они были разработаны в бактериях, большая часть вдохновения для методов рекомбинации пришла из методов, впервые разработанных в Saccharomyces cerevisiae [2] , где линейная плазмида использовалась для нацеливания генов или клонирования генов вне хромосомы. Кроме того, рекомбинация с одноцепочечными олигонуклеотидами (олиго) была впервые показана в Saccharomyces cerevisiae . [3] Было замечено, что рекомбинация происходит с олигонуклеотидами длиной всего 20 оснований.

Рекомбинация основана на гомологичной рекомбинации в Escherichia coli , опосредованной белками бактериофага , либо RecE/RecT из профага Rac [4], либо Redαβδ из бактериофага лямбда . [5] [6] Система рекомбинации лямбда Red в настоящее время используется чаще всего, и первые демонстрации генной инженерии Red in vivo были независимо проведены Кенаном Мерфи [7] и Фрэнсисом Стюартом. [4] [5] Однако эксперименты Мерфи требовали экспрессии RecA, а также использовали длинные плечи гомологии. Следовательно, последствия для новой технологии ДНК-инженерии не были очевидны. Лаборатория Стюарта показала, что эти системы гомологичной рекомбинации опосредуют эффективную рекомбинацию линейных молекул ДНК, фланкированных гомологичными последовательностями длиной всего 30 пар оснований (40-50 пар оснований более эффективны), в целевые последовательности ДНК в отсутствие RecA. Теперь гомологию можно было обеспечить с помощью олигонуклеотидов, изготовленных на заказ, и можно было использовать стандартные хозяева клонирования recA , что значительно расширяло возможности рекомбинации.

Рекомбинация с двухцепочечной ДНК

Рекомбинация использует линейные субстраты ДНК, которые являются либо двухцепочечными (dsDNA), либо одноцепочечными (ssDNA). Чаще всего рекомбинация dsDNA использовалась для создания замен, делеций, вставок и инверсий генов. Клонирование генов [6] [8] и маркировка генов/белков (теги His и т. д., см. [9] ) также распространены. Для замен или делеций генов обычно кассета, кодирующая ген устойчивости к лекарственным препаратам, создается с помощью ПЦР с использованием двусоставных праймеров. Эти праймеры состоят из (от 5'→3') 50 оснований гомологии с целевой областью, куда должна быть вставлена ​​кассета, за которыми следуют 20 оснований для праймирования кассеты устойчивости к лекарственным препаратам. Точная последовательность соединения конечной конструкции определяется дизайном праймера. [10] [11] Эти события обычно происходят с частотой примерно 10 4 /10 8 клеток, которые выживают при электропорации . Электропорация — это метод, используемый для преобразования линейного субстрата в рекомбинирующую клетку.

Методика отбора/контрселекции

В некоторых случаях требуется делеция без оставления маркера, чтобы осуществить слияние генов или создать точечный мутант в гене. Это можно сделать с помощью двух раундов рекомбинации. [12] На первом этапе рекомбинации в кассету вводится маркер отбора для замены области, подлежащей модификации. На втором этапе в кассете выбирается второй маркер контрселекции (например, sacB) против последующего введения целевого фрагмента, содержащего желаемую модификацию. В качестве альтернативы целевой фрагмент может быть фланкирован сайтами loxP или FRT , которые могут быть удалены позже просто путем экспрессии рекомбиназ Cre или FLP соответственно. Также был разработан новый маркер отбора «mFabI» для повышения эффективности рекомбинации. [13]

Рекомбинация с одноцепочечной ДНК

Рекомбинация с одноцепочечной ДНК обеспечила прорыв как в эффективности реакции, так и в простоте создания точечных мутаций. [1] Эта техника была дополнительно усовершенствована открытием того, что, избегая метил-направленной системы исправления ошибок, можно увеличить частоту получения рекомбинантов до более чем 10 7 /10 8 жизнеспособных клеток. [14] Эта частота достаточно высока, чтобы изменения теперь можно было вносить без отбора. При оптимизированных протоколах более 50% клеток, выживших после электропорации, содержат желаемое изменение. Рекомбинация с одноцепочечной ДНК требует только белка Red Beta; Exo, Gamma и белки рекомбинации хозяина не требуются. Поскольку белки, гомологичные Beta и RecT, обнаружены во многих бактериях и бактериофагах (>100 по состоянию на февраль 2010 г.), рекомбинация, вероятно, будет работать во многих различных бактериях. [15] Таким образом, рекомбинация с одноцепочечной ДНК расширяет генетические инструменты, доступные для исследований на различных организмах. На сегодняшний день рекомбинация была проведена в E. coli , S. enterica , Y. pseudotuberculosis , S. cerevisiae и M. tuberculosis . [16] [17] [18] [19] [20] [21]

Независимая от красного рекомбинация

В 2010 году было продемонстрировано, что рекомбинация одноцепочечной ДНК может происходить при отсутствии известных функций рекомбинации. [22] Рекомбинанты были обнаружены в количестве до 10 4 /10 8 жизнеспособных клеток. Эта независимая от Red активность была продемонстрирована в P. syringae , E. coli , S. enterica serovar typhimurium и S. flexneria .

Применение и преимущества рекомбинации

Самым большим преимуществом рекомбинации является то, что она устраняет необходимость в удобно расположенных сайтах рестрикции , тогда как в обычной генной инженерии модификация ДНК часто скомпрометирована доступностью уникальных сайтов рестрикции. При проектировании больших конструкций размером >100 кб, таких как бактериальные искусственные хромосомы (BAC) или хромосомы, рекомбинация стала необходимостью. Рекомбинация может генерировать желаемые модификации, не оставляя никаких «следов». Она также отказывается от нескольких стадий клонирования для создания промежуточных векторов и поэтому используется для модификации конструкций ДНК в относительно короткие сроки. Требуемая гомология достаточно коротка, чтобы ее можно было генерировать в синтетических олигонуклеотидах, а рекомбинация с короткими олигонуклеотидами сама по себе невероятно эффективна. Недавно рекомбинация была разработана для высокопроизводительных приложений в области ДНК-инженерии, называемых «конвейерами рекомбинации». [23] Рекомбинирующие конвейеры поддерживают крупномасштабное производство трансгенов BAC и конструкций для нацеливания генов для программ функциональной геномики, таких как EUCOMM (Европейский консорциум условного мутагенеза мышей) и KOMP (Программа нокаутирования мышей). Рекомбинирование также было автоматизировано, процесс называется «MAGE» - мультиплексная автоматизированная генная инженерия, в лаборатории Чёрча. [24] С развитием технологий CRISPR, создание штаммов интерференции CRISPR в E. coli требует только одношаговой олиго-рекомбинации, что обеспечивает простой и легкий в реализации инструмент для контроля экспрессии генов. [12] [25] «Инструменты рекомбинации» и лабораторные протоколы также были реализованы для ряда видов растений. Эти инструменты и процедуры настраиваются, масштабируются и свободно доступны всем исследователям. [26]

Ссылки

  1. ^ ab Ellis HM, Yu D., DiTizio T., Court DL (2001). «Высокоэффективный мутагенез, репарация и инженерия хромосомной ДНК с использованием одноцепочечных олигонуклеотидов». Труды Национальной академии наук . 98 (12): 6742–6746. Bibcode : 2001PNAS...98.6742E. doi : 10.1073 /pnas.121164898 . PMC  34423. PMID  11381128.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  2. ^ Орр-Уивер, TL, Дж. В. Шостак и др. (1983) Генетические применения трансформации дрожжей с линейными и щелевыми плазмидами. Методы. Энзимол. 101: 228-245.
  3. ^ Moerschell RP, Tsunasawa S.; et al. (1988). «Трансформация дрожжей с помощью синтетических олигонуклеотидов». Труды Национальной академии наук . 85 (2): 524–528. Bibcode :1988PNAS...85..524M. doi : 10.1073/pnas.85.2.524 . PMC 279583 . PMID  2829192. 
  4. ^ ab Zhang Y., Buchholz F., Muyrers JP, Stewart AF (1998). «Новая логика для ДНК-инженерии с использованием рекомбинации в Escherichia coli». Nature Genetics . 20 (2): 123–128. doi :10.1038/2417. PMID  9771703. S2CID  21186444.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  5. ^ ab Muyrers JP, Zhang Y., Testa G., Stewart AF (1999). «Быстрая модификация искусственных хромосом бактерий с помощью ET-рекомбинации». Nucleic Acids Research . 27 (6): 1555–1557. doi :10.1093/nar/27.6.1555. PMC 148353. PMID  10037821 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  6. ^ ab Yu D., Ellis HM; et al. (2000). "Эффективная система рекомбинации для хромосомной инженерии в Escherichia coli". Труды Национальной академии наук . 97 (11): 5978–5983. Bibcode :2000PNAS...97.5978Y. doi : 10.1073/pnas.100127597 . PMC 18544 . PMID  10811905. 
  7. ^ Murphy KC (1998). «Использование функций рекомбинации бактериофага λ для содействия замене генов в Escherichia coli». Журнал бактериологии . 180 (8): 2063–2071. doi :10.1128/JB.180.8.2063-2071.1998. PMC 107131. PMID  9555887 . 
  8. ^ Чжан, И., Мюрерс, Дж. П. П., Теста, Г. и Стюарт, А. Ф. (2000) Клонирование ДНК с помощью гомологичной рекомбинации в Escherichia coli Nature Biotechnology 18, 1314 - 1317
  9. ^ Poser I, Sarov M, Hutchins JR, Hériché JK, Toyoda Y, Pozniakovsky A, Weigl D, Nitzsche A, Hegemann B, Bird AW, Pelletier L, Kittler R, Hua S, Naumann R, Augsburg M, Sykora MM, Hofemeister H, Zhang Y, Nasmyth K, White KP, Dietzel S, Mechtler K, Durbin R, Stewart AF, Peters JM, Buchholz F, Hyman AA (2008). "BAC TransgeneOmics: высокопроизводительный метод исследования функции белка у млекопитающих". Nature Methods . 5 (5): 409–15. doi :10.1038/nmeth.1199. PMC 2871289 . PMID  18391959. {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  10. ^ Sawitzke JA, Thomason LC, Costantino N., Bubunenko M., Datta S., Court DL (2007). "Рекомбинация: генная инженерия in vivo в E. coli, S. enterica и далее". Advanced Bacterial Genetics: Use of Transposons and Phage for Genomic Engineering . Methods in Enzymology. Vol. 421. pp. 171–199. doi :10.1016/S0076-6879(06)21015-2. ISBN 9780123737496. PMID  17352923.{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  11. ^ Томасон, Л., Д. Л. Корт, М. Бубуненко, Н. Костантино, Х. Уилсон, С. Датта и А. Оппенгейм, (2007) Рекомбинация: генная инженерия бактерий с использованием гомологичной рекомбинации. В: Текущие протоколы в молекулярной биологии. Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons, Inc., стр. Глава 1, подраздел 16, стр. 11–24.
  12. ^ ab Li, X; Thomason, LC; Sawitzke, JA; Costantino, N; Court, DL (2013). "Положительный и отрицательный отбор с использованием кассеты tetA-sacB: рекомбинация и трансдукция P1 в Escherichia coli". Nucleic Acids Research . 41 (22): e204. doi :10.1093/nar/gkt1075. PMC 3905872. PMID  24203710 . 
  13. ^ Новый селективный маркер для эффективного клонирования и рекомбинации ДНК в E. coli
  14. ^ Costantino N., Court DL (2003). «Повышенные уровни λ Red-опосредованных рекомбинантов в мутантах с несоответствием». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 100 (26): 15748–15753. Bibcode : 2003PNAS..10015748C. doi : 10.1073/pnas.2434959100 . PMC 307639. PMID  14673109 . 
  15. ^ Datta S., Costantino N., Zhou X., Court DL (2008). «Идентификация и анализ рекомбинационных функций грамотрицательных и грамположительных бактерий и их фагов». Труды Национальной академии наук . 105 (5): 1626–1631. Bibcode : 2008PNAS..105.1626D. doi : 10.1073/pnas.0709089105 . PMC 2234195. PMID  18230724 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  16. ^ Дербис, А., Б. Лесик, Д. Дашо, Дж. М. Гиго и Э. Карниэль, (2003) Быстрый и простой метод инактивации хромосомных генов у иерсиний. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 38: 113-116.
  17. ^ van Kessel JC, Hatfull GF (2007). «Рекомбинация в Mycobacterium tuberculosis». Nature Methods . 4 (2): 147–152. doi :10.1038/nmeth996. PMID  17179933. S2CID  2990045.
  18. ^ van Kessel JC, Hatfull GF (2008). "Рекомбинация микобактерий". Протоколы микобактерий . Методы в молекулярной биологии. Т. 435. С. 203–215. doi :10.1007/978-1-4939-2450-9_10. ISBN 978-1-4939-2449-3. PMID  25779316.
  19. ^ van Kessel JC, Hatfull GF (2008). «Эффективный точечный мутагенез в микобактериях с использованием рекомбинации одноцепочечной ДНК: характеристика мишеней антимикобактериальных препаратов». Молекулярная микробиология . 67 (5): 1094–1107. doi :10.1111/j.1365-2958.2008.06109.x. PMID  18221264. S2CID  12136889.
  20. ^ van Kessel JC, Marinelli LJ, Hatfull GF (2008). «Рекомбинация микобактерий и их фагов». Nature Reviews Microbiology . 6 (11): 851–857. doi :10.1038/nrmicro2014. PMC 3503148. PMID  18923412 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  21. ^ ДиКарло Джеймс Э., Конли Эндрю Дж., Пенттиля Мерья, Янтти Юсси, Ван Харрис Х., Чёрч Джордж М. (2013). «Инженерия генома с использованием дрожжевых олигонуклеотидов (YOGE)». ACS Synthetic Biology . 2 (12): 741–749. doi :10.1021/sb400117c. PMC 4048964. PMID  24160921 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  22. ^ Swingle B., Markel E., Costantino N., Bubunenko MG, Cartinhour S., Court DL (2010). «Рекомбинация олигонуклеотидов у грамотрицательных бактерий». Молекулярная микробиология . 75 (1): 138–148. doi :10.1111/j.1365-2958.2009.06976.x. PMC 3404488. PMID  19943907 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  23. ^ Саров М., Шнайдер С., Позняковски А., Рогуев А., Эрнст С., Чжан И., Хайман А.А., Стюарт А.Ф. (2006). «Рекомбинирующий конвейер для функциональной геномики, применяемый к Caenorhabditis elegans». Nature Methods . 3 (10): 839–844. doi :10.1038/nmeth933. PMID  16990816. S2CID  10658504.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  24. ^ Wang HH, Isaacs FJ, Carr PA, Sun ZZ, Xu G., Forest CR, Church GM (2009). «Программирование клеток с помощью мультиплексной генной инженерии и ускоренной эволюции». Nature . 460 (7257): 894–898. Bibcode :2009Natur.460..894W. doi :10.1038/nature08187. PMC 4590770 . PMID  19633652. {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  25. ^ Ли, X; Джун, Y; Эрикстад, M; Браун, S; Паркс, A; Корт, D; Джун, S (2016). "tCRISPRi: настраиваемый и обратимый одношаговый контроль экспрессии генов". Scientific Reports . 6 : 39096. Bibcode :2016NatSR...639076L. doi :10.1038/srep39076. PMC 5171832 . PMID  27996021. 
  26. ^ Brumos J, Zhao C, Gong Y, Soriano D, Patel AP, Perez-Amador MA, Stepanova AN, Alonso JM (2019). «Улучшенный набор инструментов рекомбинации для растений». The Plant Cell . 32 (1): 100–122. doi :10.1105/tpc.19.00431. PMC 6961616. PMID  31666295 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  • redrecombineering.ncifcrf.gov — подробная информация о рекомбинации, а также протоколы, часто задаваемые вопросы. Может использоваться для запроса штаммов и плазмид, необходимых для рекомбинации.
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Рекомбинирование&oldid=1088965708"