РЕЗОЛЮЦИЯ

RESOLFT , аббревиатура от RE versible S aturable Optica L Fluorescence Transitions , обозначает группу методов оптической флуоресцентной микроскопии с очень высоким разрешением. Используя стандартную оптику видимого света дальнего поля, можно получить разрешение намного ниже дифракционного предела вплоть до молекулярных масштабов.

При использовании традиционных методов микроскопии невозможно различить особенности, которые находятся на расстоянии менее половины используемой длины волны (т. е. около 200 нм для видимого света ). Этот дифракционный предел основан на волновой природе света . В традиционных микроскопах предел определяется используемой длиной волны и числовой апертурой оптической системы. Концепция RESOLFT преодолевает этот предел, временно переключая молекулы в состояние, в котором они не могут посылать (флуоресцентный) сигнал при освещении. Эта концепция отличается, например, от электронной микроскопии , где вместо этого используемая длина волны намного меньше.

Микроскопия RESOLFT — это оптическая микроскопия с очень высоким разрешением, которая может отображать детали в образцах, которые невозможно отобразить с помощью обычной или конфокальной микроскопии . В RESOLFT обобщены принципы микроскопии STED ^{[1] [2]} и микроскопии GSD . Структуры, которые обычно расположены слишком близко друг к другу, чтобы их можно было различить, считываются последовательно.

В рамках этой структуры можно объяснить все методы, которые работают с молекулами, имеющими по крайней мере два различимых состояния, где возможно обратимое переключение между двумя состояниями и где по крайней мере один такой переход может быть оптически индуцирован.

В большинстве случаев используются флуоресцентные маркеры, где одно состояние (A) яркое, то есть генерирует сигнал флуоресценции, а другое состояние (B) темное, и не дает сигнала. Один переход между ними может быть вызван светом (например, A→B, от яркого к темному).

Образец освещается неоднородно, причем интенсивность освещения в одном положении очень мала (нуль при идеальных условиях). Только в этом месте молекулы никогда не находятся в темном состоянии B (если A является предсуществующим состоянием) и остаются полностью в ярком состоянии A. Область, где молекулы в основном находятся в ярком состоянии, можно сделать очень маленькой (меньше обычного дифракционного предела) путем увеличения интенсивности переходного света (см. ниже). Таким образом, известно, что любой обнаруженный сигнал исходит только от молекул в небольшой области вокруг минимума интенсивности освещения. Изображение с высоким разрешением можно построить путем сканирования образца, т. е. смещения профиля освещения по поверхности. ^[3]

Переход обратно из B в A может быть спонтанным или вызванным светом другой длины волны. Молекулы должны быть переключаемыми несколько раз, чтобы присутствовать в состоянии A или B в разное время во время сканирования образца. Метод также работает, если яркое и темное состояние поменять местами, тогда получается негативное изображение.

В RESOLFT область, в которой молекулы находятся в состоянии A (яркое состояние), можно сделать сколь угодно малой, несмотря на дифракционный предел.

• Необходимо осветить образец неоднородно, чтобы создать изолированную точку нулевой интенсивности. Этого можно достичь, например, с помощью интерференции.
• При низкой интенсивности (ниже синей линии на изображении) большинство молекул маркеров находятся в ярком состоянии, если интенсивность выше, большинство маркеров находятся в темном состоянии.

При слабом освещении мы видим, что область, где молекулы остаются в состоянии A, все еще довольно велика, поскольку освещение настолько слабое, что большинство молекул находятся в состоянии A. Форму профиля освещения менять не нужно. Увеличение яркости освещения уже приводит к меньшей области, где интенсивность ниже величины для эффективного переключения в темное состояние. Следовательно, также уменьшается область, где молекулы могут находиться в состоянии A. Сигнал (флуоресценции) во время последующего считывания исходит из очень маленького пятна, и можно получить очень четкие изображения.

В концепции RESOLFT разрешение может быть аппроксимировано как , где — характерная интенсивность, необходимая для насыщения перехода (половина молекул остаются в состоянии A, а половина — в состоянии B), а — применяемая интенсивность. Если минимумы создаются фокусирующей оптикой с числовой апертурой , то минимальное расстояние, на котором можно различить два идентичных объекта, равно , которое можно рассматривать как расширение уравнения Аббе . Неограниченная дифракцией природа семейства концепций RESOLFT отражается в том факте, что минимальное разрешимое расстояние может быть непрерывно уменьшено путем увеличения . Следовательно, поиск наномасштабного разрешения сводится к максимизации этой величины. Это возможно путем увеличения или уменьшения .${\displaystyle \Delta d\simeq {\frac {\lambda }{\pi n{\sqrt {\frac {I}{Isat}}}}}}$${\displaystyle Я_{сидел}}$${\displaystyle Я}$${\displaystyle {\mbox{NA}}=n\sin \alpha }$${\displaystyle \Delta d={\frac {\lambda }{2n\cdot \sin \alpha \cdot {\sqrt {1+{\frac {I}{Isat}}}}}}}$${\displaystyle \Дельта d}$${\displaystyle \varsigma = {\frac {I}{Исат}}}$${\displaystyle Я}$${\displaystyle Я_{сидел}}$

При переключении молекулярных состояний используются различные процессы. Однако все они имеют общее то, что используются по крайней мере два различимых состояния. Обычно используемое свойство флуоресценции отмечает различие состояний, однако это не является существенным, поскольку свойства поглощения или рассеивания также могут быть использованы. ^[4]

(Основная статья STED микроскопия )

В микроскопии STED (микроскопия с истощением стимулированной эмиссии) ^{[1] [2]} молекула флуоресцентного красителя перемещается между своим основным электронным состоянием и возбужденным состоянием, посылая при этом флуоресцентные фотоны. Это стандартный режим работы во флуоресцентной микроскопии, который отображает состояние A. В состоянии B краситель постоянно удерживается в своем основном электронном состоянии посредством стимулированной эмиссии . Если краситель может флуоресцировать в состоянии A и не может в состоянии B, применяется концепция RESOLFT.

(Основная статья микроскопия GSD )

Микроскопия GSD (микроскопия истощения основного состояния) также использует флуоресцентные маркеры. В состоянии A молекула может свободно перемещаться между основным и первым возбужденным состоянием, и может быть послана флуоресценция. В темном состоянии B основное состояние молекулы депопуляция, происходит переход в долгоживущее возбужденное состояние, из которого флуоресценция не испускается. Пока молекула находится в темном состоянии, она недоступна для циклирования между основным и возбужденным состоянием, поэтому флуоресценция выключена.

SPEM (микроскопия с насыщенным возбуждением) ^[5] и SSIM (микроскопия с насыщенным структурированным освещением) ^[6] используют концепцию RESOLFT, используя насыщенное возбуждение для получения «негативных» изображений, т. е. флуоресценция происходит отовсюду, за исключением очень маленькой области вокруг геометрического фокуса микроскопа. Также для освещения используются неточечные узоры. Математическая реконструкция изображения необходима для получения позитивных изображений снова.

Некоторые флуоресцентные белки могут включаться и выключаться светом соответствующей длины волны. Их можно использовать в микроскопе типа RESOLFT. ^[7] Во время освещения светом эти белки изменяют свою конформацию. В процессе они приобретают или теряют способность испускать флуоресценцию. Флуоресцентное состояние соответствует состоянию A, нефлуоресцентное — состоянию B, и концепция RESOLFT применяется снова. Обратимый переход (например, из B обратно в A) происходит либо спонтанно, либо снова под действием света. Индуцирование конформационных изменений в белках может быть достигнуто уже при гораздо более низких интенсивностях света переключения по сравнению со стимулированным излучением или истощением основного состояния (несколько Вт/см2 ⁾ . В сочетании с микроскопией 4Pi были получены изображения с изотропным разрешением ниже 40 нм живых клеток при низких уровнях освещенности. ^[8]

Как и в случае с белками, некоторые органические красители могут изменять свою структуру при освещении. ^{[9] [10]} Способность флуоресцировать такие органические красители можно включать и выключать с помощью видимого света. Опять же, интенсивность применяемого света может быть довольно низкой (около 100 Вт/см ² ).