Количественный ПЦР-инструмент

Количественный ПЦР-инструмент [1] представляет собой машину, которая амплифицирует и обнаруживает ДНК . Он сочетает в себе функции термоциклера и флуориметра , позволяя проводить количественную ПЦР .

Первая машина для количественной ПЦР была описана в 1993 году [2] , а две коммерческие модели стали доступны в 1996 году. К 2009 году было предложено восемнадцать различных моделей от семи различных производителей. [3] Цены варьируются от примерно 4300 долларов США [4] до 150 000 долларов США [5].

Основными параметрами производительности приборов для количественной ПЦР являются температурный контроль, флуориметрия и производительность пробоотбора.

Термоконтроль

Эффективное проведение количественной ПЦР требует быстрого и точного температурного контроля.

Было продемонстрировано, что 30 циклов ПЦР занимают менее 10 минут. [6] Быстрое циклирование обеспечивает ряд преимуществ, включая сокращение времени получения результата, повышение производительности системы и улучшение специфичности реакции. [7] Однако на практике инженерные компромиссы между простотой использования, однородностью температуры и скоростью приводят к тому, что время реакции обычно превышает 25 минут. [3]

Тепловая неоднородность во время температурного цикла способствует изменчивости ПЦР [8] [9] [10] и, к сожалению, некоторые термоциклеры не соответствуют спецификациям, заявленным производителями. [11] Увеличение скорости термоциклирования обычно снижает тепловую однородность и может снизить точность количественной ПЦР . [12]

Равномерность температуры также напрямую влияет на способность различать различные продукты ПЦР путем проведения анализа точки плавления. [13] Помимо равномерности, разрешение, с которым приборы способны контролировать температуру, является фактором, который влияет на их производительность при проведении анализов плавления с высоким разрешением . [14]

Поэтому скорость, точность и равномерность термоконтроля являются важными эксплуатационными характеристиками приборов для количественной ПЦР.

Флуориметрия

Приборы для количественной ПЦР контролируют ход ПЦР и природу амплифицированных продуктов путем измерения флуоресценции .

Диапазон различных флуоресцентных меток, которые можно контролировать, точность, с которой их можно измерить, и способность различать сигналы от разных меток являются важными эксплуатационными характеристиками.

Используя инструмент с достаточным количеством оптических каналов и обширной оптимизацией анализа, можно одновременно количественно определить до 7 отдельных целей в одной реакции ПЦР. [15] Однако даже при обширной оптимизации эффективный динамический диапазон таких мультиплексных анализов часто сокращается из-за помех между составляющими реакциями. [16]

Шум в измерениях флуоресценции влияет на точность qPCR. Обычно это функция изменения интенсивности источника возбуждения, шума детектора и механического шума. Многофакторный анализ показал, что вклад механического шума является наиболее важным фактором, и что системы без подвижных частей на оптических путях, вероятно, обеспечат улучшенную количественную точность. [10]

Кроме того, при выполнении анализа плавления с высоким разрешением одним из факторов, влияющих на чувствительность обнаружения гетеродуплекса, является флуориметрическая точность. [14]

Поэтому количество оптических каналов и уровень шума при измерениях флуоресценции также являются важными эксплуатационными характеристиками приборов для количественной ПЦР .

Ссылки

  1. ^ Иногда его также называют «прибором для ПЦР в реальном времени».
  2. ^ Хигучи, Р.; Доллингер, Г.; Уолш, П.С.; Гриффит, Р. (1992), «Одновременная амплификация и обнаружение специфических последовательностей ДНК», Bio/Technology , 10 (4): 413–7 , doi :10.1038/nbt0492-413, PMID  1368485, S2CID  1684150
  3. ^ ab Logan, J.; Edwards, K. (январь 2009). "Глава 2. Обзор платформ ПЦР". В Saunders, N. (ред.). Real-Time PCR: Current Technology and Applications . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4.
  4. ^ Open qPCR с открытым исходным кодом ПЦР-машина в реальном времени
  5. ^ Ма, Х.; Шие, К.; Чен, Г.; Чен, Х.; Чуан, М. (2006), «Применение полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР)», Журнал американской науки , 2 (3 ) : 1–15
  6. ^ Рагхаван, В.; Уитни, С.; Эбмейер, Р.; Падхай, Н.; Нельсон, М. Вилджоен; Гогос, Г. (2006), «Термический анализ термоциклера на основе вихревой трубки для быстрой амплификации ДНК: экспериментальные и двумерные численные результаты», Обзор научных инструментов , 77 (9): 094301–094301–9, Bibcode : 2006RScI...77i4301R, doi : 10.1063/1.2338283
  7. ^ Wittwer, CT; Garling, DJ (1991), «Быстрый цикл амплификации ДНК: оптимизация времени и температуры», BioTechniques , 10 (1): 76–83 , PMID  2003928
  8. ^ Ким, YH; Янг, I.; Бэ, YS; Парк, SR (2008), «Оценка производительности термоциклеров для ПЦР в условиях быстрого циклирования», BioTechniques , 44 (4): 495–6 , doi : 10.2144/000112705 , PMID  18476814
  9. ^ Шодер, Д.; Шмальвизер, А.; Шаубергер, Г.; Кун, М.; Хорфар, Дж.; Вагнер, М. (2003), «Физические характеристики шести новых термоциклеров», Clin. Chem. , 49 (6): 960– 3, doi :10.1373/49.6.960, PMID  12765996
  10. ^ ab Lee, D. -S. (2010). "Моделирование системы машины ПЦР в реальном времени и систематический подход к надежному проектированию системы ПЦР в реальном времени на чипе". Датчики . 10 (1): 697– 718. Bibcode : 2010Senso..10..697L . doi : 10.3390/s100100697 . PMC 3270864. PMID  22315563. 
  11. ^ Шодер, Д.; Шмальвизер, А.; Шаубергер, Г.; Хорфар, Дж.; Кун, М.; Вагнер, М. (2005), «Новый подход к оценке производительности ПЦР-циклеров, используемых для диагностического тестирования», J Clin Microbiol , 43 (6): 2724– 8, doi :10.1128/jcm.43.6.2724-2728.2005, PMC 1151936 , PMID  15956389 
  12. ^ Хильшер, К.; Вахрсон, В.; Диттмер, Д.П. (2005), «Более быстрые количественные протоколы ПЦР в реальном времени могут потерять чувствительность и показать повышенную изменчивость», Nucleic Acids Res. , 33 (21): e182, doi :10.1093/nar/gni181, PMC 1297710 , PMID  16314296 
  13. ^ Herrmann, M.; Durtschi, J.; Wittwer, C.; Voelkerding, K. (2007). «Расширенное сравнение инструментов анализа плавления ампликона ДНК для сканирования мутаций и генотипирования». Клиническая химия . 53 (8): 1544–1548 . doi : 10.1373/clinchem.2007.088120 . PMID  17556647.
  14. ^ ab Gundry, C.; Vandersteen, J.; Reed, G.; Pryor, R.; Chen, J.; Wittwer, C. (2003). «Анализ плавления ампликонов с мечеными праймерами: метод закрытой пробирки для дифференциации гомозигот и гетерозигот». Clinical Chemistry . 49 (3): 396– 406. doi : 10.1373/49.3.396 . PMID  12600951.
  15. ^ Köppel, R.; Zimmerli, F.; Breitenmoser, A. (2009), «Heptaplex Real-Time PCR для идентификации и количественной оценки ДНК из говядины, свинины, курицы, индейки, конины, баранины и козлятины», European Food Research and Technology , 230 : 125–33 , doi :10.1007/s00217-009-1154-5, S2CID  96340566
  16. ^ Bahrdt, C.; Krech, A.; Wurz, A.; Wulff, D. (2010). «Валидация недавно разработанного гексаплексного ПЦР-анализа в реальном времени для скрининга на наличие ГМО в пищевых продуктах, кормах и семенах». Аналитическая и биоаналитическая химия . 396 (6): 2103– 2112. doi :10.1007/s00216-009-3380-x. PMID  20101506. S2CID  22657985.
  • Доступные амплификаторы ПЦР в реальном времени
  • Особенности платформ ПЦР в реальном времени и машин для количественной ПЦР
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Количественный_ПЦР_инструмент&oldid=1221750338"