Нападки на промоутеров

Promoter bashing — это метод, используемый в молекулярной биологии для определения того, как определенные области цепи ДНК , обычно промоторы , влияют на транскрипцию нижестоящих генов. При нормальных обстоятельствах белки связываются с промотором и активируют или подавляют транскрипцию. В анализе propomer bashing производятся определенные точечные мутации или делеции в определенных областях промотора, а затем измеряется транскрипция гена. Вклад области промотора можно наблюдать по уровню транскрипции. Если мутация или делеция изменяет уровень транскрипции, то известно, что эта область промотора может быть сайтом связывания или другим регуляторным элементом. ^[1]^[2]^[3]

Промоторный башинг часто выполняется с делециями либо с 5'- , либо с 3'- конца цепи ДНК; этот анализ легче выполнять на основе повторного рестриктного расщепления и гель-очистки фрагментов определенных размеров. Часто проще всего лигировать промотор в репортер, сгенерировать большое количество репортерной конструкции с помощью ПЦР или выращивания в бактериях, а затем выполнить серийные рестриктные расщепления на этом образце. Способность восходящих промоторов можно легко проанализировать, удалив сегменты с 5'-конца, и то же самое для 3'-конца цепи для нисходящих промоторов. ^[4]

Поскольку промотор обычно содержит связывающие последовательности для белков, влияющих на транскрипцию, эти белки также необходимы при тестировании эффектов промотора. Белки, которые ассоциируются с промотором, можно идентифицировать с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA), а эффекты включения или исключения белков с мутагенизированными промоторами можно оценить в анализе. Это позволяет использовать башинг промотора не только для обнаружения местоположения на цепи ДНК, которое влияет на транскрипцию, но и белков, которые влияют на эту цепь. Эффекты взаимодействия белков друг с другом, а также сайты связывания также можно анализировать таким образом; кандидаты на белки должны быть идентифицированы с помощью анализов взаимодействия белок/белок вместо EMSA. ^[5]

Процедура

Это пример процедуры анализа воздействия на промоутер, адаптированный из работы Булена и др.: [ ^6]

Клонируйте область ДНК, которая, как предполагается, действует как промотор. Клонирование необходимо для анализа, поскольку оно гарантирует, что промотор является единственным фактором, влияющим на экспрессию. Этот шаг часто включает в себя извлечение ДНК из организма, в котором она находится, и ПЦР- амплификацию.
Секвенируйте регион. Секвенирование ДНК необходимо для выявления различий в мутировавших промоторах от промотора дикого типа и для корреляции этих различий с различиями в экспрессии генов. Кроме того, оно помогает с рестрикционным расщеплением региона.
Расщепление соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Регион может быть расщеплён для удаления элементов, которые, как считается, не являются частью промотора. Кроме того, репортерный ген должен быть вставлен на заданном расстоянии от промотора для большинства промоутеров. В некоторых методах башинга промотора используются множественные рестрикционные расщепления для систематического удаления элементов промоутеров — этот метод гарантирует, что области удаляемого промотора не будут способствовать экспрессии репортера .
Мутагенизировать промотор. Мутация промотора необходима, если не используется метод удаления части промотора с помощью рестриктазы. Можно сгенерировать много мутированных цепей, секвенировать цепи и проанализировать активность промоторов. Это часто необходимо, поскольку одна мутация не может гарантировать, что она инактивирует сайт связывания. Также можно использовать ненаправленный мутагенез на основе ПЦР; параметры мутагенной реакции ПЦР можно скорректировать для введения разумного количества мутаций. Однако случайная природа ПЦР требует, чтобы на этом этапе анализировалось больше цепей.
Лигировать в репортерный ген. Промоторы, которые необходимо проанализировать, должны быть лигированы в репортерный ген , чтобы можно было измерить уровни экспрессии гена. Репортерный ген должен находиться на достаточном расстоянии от промотора, чтобы промотор влиял на него так же, как промотор дикого типа влиял бы на ген. Это можно проверить с помощью положительного контроля (полный промотор).
Трансформируйте интересующие клетки различными конструкциями промоутер:репортер. Конструкции промоутер и репортер должны быть лигированы в плазмиду и трансформированы в клетки, в которых эта плазмида может быть экспрессирована, чтобы измерить активность каждой последовательности промоутера. Белки, которые влияют на промотор, также должны быть добавлены к этим клеткам — часто эти белки помещаются в ту же или другую плазмиду под регуляцией конститутивно активного промотора.
Измерение скорости транскрипции гена-репортера. Продукты гена анализируются, и скорость транскрипции репортера измеряется.

Из данных, полученных при анализе различных промоторов, можно установить эффекты различных частей промотора. Однако возможно, что данных может быть недостаточно, и анализ должен быть проведен повторно с другим участком промотора и/или другими мутациями.

Смотрите также

Ссылки

^ Камвисселис, М. (2003). Вычислительная молекулярная геномика: гены, регуляция, эволюция . (Докторская диссертация). Получено с http://web.mit.edu/manoli/www/thesis/Intro.html
^ Чалфи, М. и Кейн, С. (2005) Методы биологического анализа, Зеленый флуоресцентный белок: свойства, применение и протоколы . Wiley.
^ Matsukura, S., Stellato, C., Plitt, JR, Bickel, C., Miura, K., Georas, SN, Casolaro, V., Schleimer, RP (1999). «Активация транскрипции гена эотаксина с помощью NF-κB и STAT6 в эпителиальных клетках дыхательных путей человека». J Immunol 163:6876-6883. PMID 10586089.
^ Энгстром, Э.М., Ижаки, А., Боуман, Дж.Л. (2004). «Промоторный башинг, микроРНК и гены Нокса. Новые идеи, регуляторы и цели регуляции в установлении латеральной полярности органов у Arabidopsis». Plant Phisiol 135(2): 685-94. doi : 10.1104/pp.104.040394. PMID 15208415. PMC 514105.
^ Го, JY, Сюй, Дж., Мао, DQ, Фу, LL, Гу, JR, Чжу, JD (2002). «Анализ промотора человеческого гена C17orf25 , нового гена хромосомы 17p13.3». Клеточные исследования 12:339-352. дои : 10.1038/sj.cr.7290136.
^ Булен, Т. и др. Слияния репортерных генов (5 апреля 2006 г.), WormBook , ред. Исследовательское сообщество C. elegans, WormBook, doi 10.1895/wormbook.1.106.1, http://www.wormbook.org.

[1] Камвисселис, М. (2003). Вычислительная молекулярная геномика: гены, регуляция, эволюция . (Докторская диссертация). Получено с http://web.mit.edu/manoli/www/thesis/Intro.html

[2] Чалфи, М. и Кейн, С. (2005) Методы биологического анализа, Зеленый флуоресцентный белок: свойства, применение и протоколы . Wiley.

[3] Matsukura, S., Stellato, C., Plitt, JR, Bickel, C., Miura, K., Georas, SN, Casolaro, V., Schleimer, RP (1999). «Активация транскрипции гена эотаксина с помощью NF-κB и STAT6 в эпителиальных клетках дыхательных путей человека». J Immunol 163:6876-6883. PMID 10586089.

[4] Энгстром, Э.М., Ижаки, А., Боуман, Дж.Л. (2004). «Промоторный башинг, микроРНК и гены Нокса. Новые идеи, регуляторы и цели регуляции в установлении латеральной полярности органов у Arabidopsis». Plant Phisiol 135(2): 685-94. doi : 10.1104/pp.104.040394. PMID 15208415. PMC 514105.

[5] Го, JY, Сюй, Дж., Мао, DQ, Фу, LL, Гу, JR, Чжу, JD (2002). «Анализ промотора человеческого гена C17orf25 , нового гена хромосомы 17p13.3». Клеточные исследования 12:339-352. дои : 10.1038/sj.cr.7290136.

[6] Булен, Т. и др. Слияния репортерных генов (5 апреля 2006 г.), WormBook , ред. Исследовательское сообщество C. elegans, WormBook, doi 10.1895/wormbook.1.106.1, http://www.wormbook.org.