PRIME (метод маркировки)

PRIME ( включение зонда, опосредованное ферментами ) — это инструмент для молекулярной биологии, разработанный Элис Й. Тинг и лабораторией Тинга в Массачусетском технологическом институте для сайт-специфической маркировки белков в живых клетках с помощью химических зондов. [1] [2] Зонды часто обладают полезными биофизическими свойствами, такими как флуоресценция , и позволяют визуализировать белки. [1] В конечном итоге PRIME позволяет ученым изучать функции конкретных интересующих белков.

Значение

Маркировка белков флуоресцентными молекулами позволяет визуализировать динамику белков, локализацию и белок-белковые взаимодействия , и поэтому служит важным методом для понимания функций и сетей белков в живых клетках. [3] Маркировка белков должна иметь высокую селективность по отношению к интересующему белку и не должна мешать естественным функциям белка. Хотя генетическое кодирование флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), является наиболее популярной техникой из-за его высокой специфичности, флуоресцентные белки, вероятно, будут мешать функциям белка, с которым они слиты, из-за их больших размеров. [3] Существует множество инструментов маркировки, таких как HaloTag, SNAP tag и FlAsH, разработанных для того, чтобы преодолеть слабость традиционной маркировки белков флуоресцентными белками. Однако они все еще имеют существенные недостатки либо из-за большого размера метки, либо из-за низкой специфичности процесса маркировки. [4] PRIME был разработан для того, чтобы достичь высокой специфичности маркировки, сравнимой с флуоресцентными белками с небольшими молекулами. [4]

Принципы

В PRIME мутантный фермент LplA (лигаза липоевой кислоты из Escherichia coli ) сначала катализирует конъюгацию «функциональной группы» и акцепторного пептида LplA (LAP), который генетически слит с интересующим белком. [1] [4] [5] «Функциональная группа» обозначает мостиковую молекулу, соединяющую тег LAP с флуоресцентным зондом или флуорофором . Флуоресцентный зонд реагирует с «функциональной группой», связанной с тегом, и в конечном итоге маркирует интересующий белок. Для присоединения флуоресцентного зонда к комплексу, состоящему из белка, тега LAP и мостика, можно использовать различные химические реакции: реакция Дильса-Альдера , [6] и катализируемое медью азидно-алкиновое циклоприсоединение с помощью хелатирования (CuAAC) (см. Азидно-алкиновое циклоприсоединение Хьюзгена ). [7] Две другие версии технологий маркировки PRIME используют мутантные белки LplA для непосредственного включения флуорофора в интересующий белок, помеченный LAP. [8] [9]

Ограничения

Несмотря на преимущества PRIME по сравнению с другими методами маркировки, PRIME все еще имеет некоторые возможные ограничения. Во-первых, метка LAP может мешать функционированию белков, с которыми она слита. [1] Экспериментаторам рекомендуется проводить контрольные эксперименты, чтобы убедиться, что маркированный рекомбинантный белок функционирует должным образом. [1] Во-вторых, даже при низкой концентрации химические вещества, такие как флуоресцентный зонд, могут быть токсичными для клеток. [1] Экспериментаторам также необходимо получить правильный баланс между максимальным сигналом флуоресценции и минимальным нарушением клеточной функции. [1]

Ссылки

  1. ^ abcdefg Uttamapinant C, Sanchez MI, Liu DS, Yao JZ, Ting AY (август 2013 г.). «Сайт-специфическая маркировка белков с использованием PRIME и хелатирующей клик-химии». Nat Protoc . 8 (8): 1620– 34. doi :10.1038/nprot.2013.096. PMC  4892701. PMID  23887180.
  2. ^ Чеше Х, изд. (2011). Методы биохимии белков . Берлин: Де Грюйтер. ISBN 978-3-11-025236-1.
  3. ^ ab Soh N (19 февраля 2008 г.). «Селективная химическая маркировка белков малыми флуоресцентными молекулами на основе метода хелатирования металлов». Датчики . 8 (2): 1004–1024 . Bibcode : 2008Senso...8.1004S. doi : 10.3390 /s8021004 . PMC 3927527. PMID  27879749. 
  4. ^ abc Yao JZ, Uttamapinant C, Poloukhtine A, Baskin JM, Codelli JA, Sletten EM, Bertozzi CR, Popik VV, Ting AY (2012). «Нацеливание флуорофора на клеточные белки с помощью ферментативно-опосредованного азидного лигирования и циклоприсоединения, стимулируемого штаммом». J. Am. Chem. Soc . 134 (8): 3720– 8. Bibcode : 2012JAChS.134.3720Y. doi : 10.1021/ja208090p. PMC 3306817. PMID  22239252 . 
  5. ^ Демченко А.П., Брауэр А.М., ред. (2011). Продвинутые флуоресцентные репортеры в химии и биологии . Гейдельберг: Springer. ISBN 978-3-642-18034-7.
  6. ^ Liu DS, Tangpeerachaikul A, Selvaraj R, Taylor MT, Fox JM, Ting AY (2012). «Циклоприсоединение Дильса-Альдера для нацеливания флуорофора на определенные белки внутри живых клеток». J. Am. Chem. Soc . 134 (2): 792– 5. Bibcode : 2012JAChS.134..792L . doi : 10.1021/ja209325n. PMC 3381951. PMID  22176354. 
  7. ^ Uttamapinant C, Tangpeerachaikul A, Grecian S, Clarke S, Singh U, Slade P, Gee KR, Ting AY (2012). «Быстрая, совместимая с клетками клик-химия с азидами, хелатирующими медь, для биомолекулярной маркировки». Angew. Chem. Int. Ed. Engl . 51 (24): 5852– 6. doi :10.1002/anie.201108181. PMC 3517120. PMID  22555882 . 
  8. ^ Uttamapinant C, White KA, Baruah H, Thompson S, Fernandez-Suarez M, Puthenveetil S, Ting AY (2010). «Флуорофорная лигаза для сайт-специфической маркировки белков внутри живых клеток». Proc Natl Acad Sci USA . 107 (24): 10914– 9. doi : 10.1073 /pnas.0914067107 . PMC 2890758. PMID  20534555. 
  9. ^ Liu DS, Nivon LG, Richter F, Goldman PJ, Deerinck TJ, Yao JZ, Phipps WS, Ellisman MH, Drennan CL, Baker D, Ting AY (2014). «Вычислительное проектирование красной флуорофорной лигазы для сайт-специфической маркировки белков в живых клетках». Proc Natl Acad Sci USA . 111 (43): E4551–9. Bibcode : 2014PNAS..111E4551L. doi : 10.1073/pnas.1404736111 . PMC 4217414. PMID  25313043 . 
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=PRIME_(метод_маркировки)&oldid=1260879250"