Усиление множественного смещения

Множественная амплификация смещением (MDA) — это метод амплификации ДНК . Этот метод позволяет быстро амплифицировать мельчайшие количества образцов ДНК до разумного количества для геномного анализа. Реакция начинается с отжига случайных гексамерных праймеров на шаблоне: синтез ДНК осуществляется высокоточным ферментом , предпочтительно ДНК-полимеразой Φ29 . По сравнению с обычными методами амплификации ПЦР , MDA не использует праймеры, специфичные для последовательности, а амплифицирует всю ДНК, генерирует продукты большего размера с более низкой частотой ошибок и работает при постоянной температуре. MDA активно используется в полногеномной амплификации (WGA) и является перспективным методом для применения в секвенировании генома отдельной клетки и генетических исследованиях на основе секвенирования.

Многие биологические и судебно-медицинские случаи, связанные с генетическим анализом, требуют секвенирования ДНК из мельчайших количеств образца, таких как ДНК из некультивированных отдельных клеток или следовых количеств ткани, собранных с мест преступлений. Обычные методы амплификации ДНК на основе полимеразной цепной реакции ( ПЦР ) требуют последовательности-специфичных олигонуклеотидных праймеров и термостабильной (обычно Taq ) полимеразы и могут использоваться для получения значительных количеств ДНК из мельчайших количеств ДНК. Однако этого недостаточно для современных методов, которые используют анализ ДНК на основе секвенирования. Поэтому необходим более эффективный неспецифичный для последовательности метод амплификации мельчайших количеств ДНК, особенно в геномных исследованиях отдельных клеток.

Бактериофаговая ДНК-полимераза Φ29 — это фермент с высокой процессивностью , способный производить ампликоны ДНК размером более 70 килобаз. ^[1] Ее высокая точность и 3'–5' корректирующая активность снижают частоту ошибок амплификации до 1 из ^{106−107 оснований} по сравнению с обычной полимеразой Taq с зарегистрированной частотой ошибок 1 из 9000. ^[2] Реакцию можно проводить в умеренных изотермических условиях при 30 °C и, следовательно, не требует термоциклера . Она активно используется в бесклеточном клонировании, которое является ферментативным методом амплификации ДНК in vitro без культивирования клеток и выделения ДНК . Большой фрагмент ДНК-полимеразы Bst также используется в MDA, но Ф29 обычно предпочтительнее из-за ее достаточного выхода продукта и корректирующей активности. ^[3]

Гексамерные праймеры представляют собой последовательности, состоящие из шести случайных нуклеотидов . Для приложений MDA эти праймеры обычно модифицированы тиофосфатом на 3'-конце, чтобы придать устойчивость к 3'–5' экзонуклеазной активности ДНК- полимеразы Ф29 . Реакции MDA начинаются с отжига таких праймеров на матрице ДНК с последующим удлинением цепи, опосредованным полимеразой. В ходе реакции амплификации происходит все больше событий отжига праймеров.

Реакция амплификации начинается, когда несколько гексамеров праймера отжигаются с шаблоном. Когда синтез ДНК переходит к следующему стартовому сайту, полимераза вытесняет вновь полученную цепь ДНК и продолжает ее удлинение. Смещение цепи генерирует вновь синтезированную одноцепочечную цепь ДНК для большего количества праймеров для отжига. Дальнейший отжиг праймера и смещение цепи на вновь синтезированном шаблоне приводит к образованию гиперразветвленной сети ДНК. Разветвление последовательности во время амплификации приводит к высокому выходу продуктов. Для разделения сети ветвления ДНК используются нуклеазы S1 для расщепления фрагментов в местах смещения. Разрывы на полученных фрагментах ДНК восстанавливаются ДНК- полимеразой I.

MDA может генерировать 1–2 мкг ДНК из одной клетки с покрытием генома до 99%. ^[4] Продукты также имеют более низкий уровень ошибок и большие размеры по сравнению с Taq -амплификацией на основе ПЦР. ^{[4] [5]}

Общий рабочий процесс MDA: ^[6]

1. Подготовка образца : Образцы собираются и разбавляются в соответствующем реакционном буфере (без Ca ²⁺ и Mg ²⁺ ). Клетки лизируются щелочным буфером .
2. Условие : Реакция МДА с полимеразой Ф29 проводится при температуре 30 °C. Реакция обычно занимает около 2,5–3 часов.
3. Конец реакции : инактивировать ферменты при 65 °C перед сбором амплифицированных продуктов ДНК.
4. Продукты ДНК можно очистить с помощью коммерческого набора для очистки.

MDA генерирует достаточный выход продуктов ДНК. Это мощный инструмент амплификации молекул ДНК из образцов, таких как некультивируемые микроорганизмы или отдельные клетки, до количества, достаточного для исследований секвенирования . Большой размер продуктов ДНК, амплифицированных MDA, также обеспечивает желаемое качество образца для определения размера полиморфных повторяющихся аллелей. Его высокая точность также делает его надежным для использования при обнаружении аллелей однонуклеотидного полиморфизма (SNP). Благодаря смещению нитей во время амплификации амплифицированная ДНК имеет достаточное покрытие исходных молекул ДНК, что обеспечивает высококачественный продукт для геномного анализа. Продукты смещенных нитей могут быть впоследствии клонированы в векторы для построения библиотеки для последующих реакций секвенирования .

ADO определяется как случайная неамплификация одного из аллелей, присутствующих в гетерозиготном образце. В некоторых исследованиях сообщалось, что скорость ADO продуктов MDA составляет 0–60%. ^[7] Этот недостаток снижает точность генотипирования отдельного образца и приводит к неправильной диагностике в других приложениях, связанных с MDA. ADO, по-видимому, не зависит от размеров фрагментов и, как сообщалось, имеет схожую скорость в других одноклеточных методах. Возможными решениями являются использование различных условий лизиса или проведение нескольких раундов амплификации из разбавленных продуктов MDA, поскольку сообщалось, что амплификация с помощью ПЦР из культивируемых клеток дает более низкие скорости ADO.

«Предпочтительная амплификация» — это избыточная амплификация одного из аллелей по сравнению с другим. Большинство исследований MDA сообщали об этой проблеме. В настоящее время наблюдается случайность смещения амплификации. Это может повлиять на анализ небольших участков геномной ДНК при идентификации аллелей коротких тандемных повторов (STR).

Эндогенное независимое от шаблона взаимодействие праймер-праймер обусловлено случайным дизайном гексамерных праймеров. Одним из возможных решений является разработка ограниченно-рандомизированных гексануклеотидных праймеров, которые не скрещиваются.

С помощью MDA были секвенированы отдельные клетки некультивируемых бактерий, архей и протистов, а также отдельные вирусные частицы и отдельные споры грибов . ^{[8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18]}

Возможность секвенирования отдельных клеток также полезна в борьбе с болезнями человека. Геномы из отдельных эмбриональных клеток человека были успешно амплифицированы для секвенирования с использованием MDA, что позволяет проводить предимплантационную генетическую диагностику (PGD): скрининг генетических проблем со здоровьем на ранней стадии эмбриона перед имплантацией . ^[19] Заболевания с гетерогенными свойствами, такие как рак , также выигрывают от способности секвенирования генома на основе MDA изучать мутации в отдельных клетках.

Продукты MDA из одной клетки также успешно использовались в экспериментах по сравнительной геномной гибридизации с использованием массивов , которые обычно требуют относительно большого количества амплифицированной ДНК.

Иммунопреципитация хроматина приводит к получению сложных смесей относительно коротких фрагментов ДНК, которые сложно амплифицировать с помощью MDA, не вызывая смещения в представлении фрагментов. Был предложен метод обхода этой проблемы, основанный на преобразовании этих смесей в кольцевые конкатемеры с использованием лигирования, за которым следует опосредованная Φ29 ДНК-полимеразой MDA. ^[20]

Следовое количество образцов, собранных с мест преступлений, может быть увеличено с помощью MDA до количества, достаточного для судебно-медицинского анализа ДНК, который обычно используется для идентификации жертв и подозреваемых.

• Полимеразная цепная реакция
• Амплификация всего генома