Молекулярная цитогенетика
Изображение: пример кариотипирования, показывающий в общей сложности 46 хромосом в геноме.

Молекулярная цитогенетика объединяет две дисциплины, молекулярную биологию и цитогенетику , и включает анализ структуры хромосом, чтобы помочь отличить нормальные и вызывающие рак клетки. Человеческая цитогенетика началась в 1956 году, когда было обнаружено, что нормальные человеческие клетки содержат 46 хромосом. Однако первые микроскопические наблюдения хромосом были опубликованы Арнольдом, Флеммингом и Ганземаном в конце 1800-х годов. Их работа игнорировалась в течение десятилетий, пока не было обнаружено фактическое число хромосом у людей — 46. В 1879 году Арнольд исследовал клетки саркомы и карциномы, имеющие очень большие ядра. Сегодня изучение молекулярной цитогенетики может быть полезным при диагностике и лечении различных злокачественных новообразований, таких как гематологические злокачественные новообразования, опухоли головного мозга и другие предшественники рака. Область в целом сосредоточена на изучении эволюции хромосом, а точнее количества, структуры, функции и происхождения хромосомных аномалий. [1] [2] Он включает в себя ряд методов, называемых флуоресцентной гибридизацией in situ , или FISH, в которых ДНК- зонды маркируются различными цветными флуоресцентными метками для визуализации одного или нескольких определенных регионов генома. Представленный в 1980-х годах, FISH использует зонды с комплементарными базовыми последовательностями для определения наличия или отсутствия определенных регионов ДНК. FISH может быть выполнен либо как прямой подход к метафазным хромосомам, либо к интерфазным ядрам. В качестве альтернативы может быть использован косвенный подход, в котором весь геном может быть оценен на предмет изменений числа копий с использованием виртуального кариотипирования. Виртуальные кариотипы генерируются из массивов, состоящих из тысяч или миллионов зондов, а вычислительные инструменты используются для воссоздания генома in silico .

Общие методы

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

FISH-изображения хромосом из делящихся клеток орангутана (слева) и человека (справа). Желтый зонд показывает 4 копии региона в геноме орангутана и только 2 копии в геноме человека.

Флуоресцентная гибридизация in situ картирует единичные копии или повторяющиеся последовательности ДНК посредством локализационной маркировки определенных нуклеиновых кислот. Метод использует различные ДНК-зонды, помеченные флуоресцентными метками, которые связываются с одним или несколькими определенными областями генома. [3] Он маркирует все отдельные хромосомы на каждой стадии деления клетки, чтобы отобразить структурные и числовые аномалии, которые могут возникнуть на протяжении всего цикла. Это делается с помощью зонда, который может быть локус-специфичным, центромерным, теломерным и полнохромосомным. Этот метод обычно применяется на интерфазных клетках и тканях парафиновых блоков. FISH картирует единичные копии или повторяющиеся последовательности ДНК посредством локализационной маркировки определенных нуклеиновых кислот. Метод использует различные ДНК-зонды, помеченные флуоресцентными метками, которые связываются с одним или несколькими определенными областями генома. Сигналы от флуоресцентных меток можно увидеть с помощью микроскопии , а мутации можно увидеть, сравнив эти сигналы со здоровыми клетками. Чтобы это сработало, ДНК должна быть денатурирована с использованием тепла или химикатов для разрыва водородных связей; это позволяет гибридизации произойти после смешивания двух образцов. Флуоресцентные зонды создают новые водородные связи, таким образом восстанавливая ДНК с их комплементарными основаниями, которые можно обнаружить с помощью микроскопии. FISH позволяет визуализировать различные части хромосомы на разных стадиях клеточного цикла. FISH может быть выполнен как прямой подход к метафазным хромосомам или интерфазным ядрам. В качестве альтернативы может быть использован косвенный подход, при котором весь геном может быть оценен на предмет изменений числа копий с использованием виртуального кариотипирования. Виртуальные кариотипы генерируются из микрочипов, состоящих из тысяч или миллионов зондов, а вычислительные инструменты используются для воссоздания генома in silico . [4]

Сравнительная геномная гибридизация (CGH)

Сравнительная геномная гибридизация (CGH), полученная из FISH, используется для сравнения вариаций в числе копий между биологическим образцом и эталоном. CGH изначально был разработан для наблюдения хромосомных аберраций в опухолевых клетках. Этот метод использует два генома, образец и контроль, которые маркируются флуоресцентно, чтобы различать их. [5] В CGH ДНК выделяется из образца опухоли и присоединяется биотин. Другой маркирующий белок, дигоксигенин, присоединяется к эталонному образцу ДНК. [6] Маркированные образцы ДНК когибридизуются с зондами во время деления клеток, что является наиболее информативным временем для наблюдения за вариациями числа копий. [7] CGH использует создание карты, которая показывает относительное обилие ДНК и число хромосом. Сравнивая флуоресценцию в образце с эталоном, CGH может указать на приобретения или потери хромосомных областей. [6] [8] CGH отличается от FISH, поскольку не требует определенной цели или предыдущих знаний об анализируемой генетической области. CGH также может относительно быстро сканировать весь геном на предмет различных хромосомных дисбалансов, и это полезно для пациентов с фоновыми генетическими проблемами и когда официальный диагноз неизвестен. Это часто происходит с гематологическими раковыми заболеваниями.

Сравнительная геномная гибридизация массива (aCGH)

Сравнительная геномная гибридизация массивов (aCGH) позволяет проводить CGH без культивирования клеток и изоляции. Вместо этого она выполняется на предметных стеклах, содержащих небольшие фрагменты ДНК. [9] Удаление этапа культивирования клеток и изоляции значительно упрощает и ускоряет процесс. Используя принципы, аналогичные CGH, образец ДНК изолируется и флуоресцентно маркируется, затем когибридизуется с одноцепочечными зондами для генерации сигналов. Тысячи этих сигналов могут быть обнаружены одновременно, и этот процесс называется параллельным скринингом. [10] Измеряются коэффициенты флуоресценции между сигналами образца и эталона, представляющие собой среднюю разницу между количеством каждого. Это покажет, больше или меньше образца ДНК, чем ожидается по эталону.

Приложения

Клетка, содержащая перестройку хромосомных регионов bcr/abl (верхняя левая красная и зеленая хромосома). Эта перестройка связана с хроническим миелоидным лейкозом и была обнаружена с помощью FISH.

Гибридизация хромосом in situ с помощью FISH позволяет изучать цитогенетику в пренатальных и постнатальных образцах, а также широко используется в цитогенетическом тестировании на рак. В то время как цитогенетика изучает хромосомы и их структуру, цитогенетическое тестирование включает анализ клеток в крови, тканях, костном мозге или жидкости для выявления изменений в хромосомах человека. Это часто делалось с помощью кариотипирования, а теперь делается с помощью FISH. Этот метод обычно используется для обнаружения хромосомных делеций или транслокаций, часто связанных с раком. FISH также используется для меланоцитарных поражений, различая атипичную меланоцитарную или злокачественную меланому. [5]

Раковые клетки часто накапливают сложные структурные изменения хромосом, такие как потеря, дупликация, инверсия или перемещение сегмента. [11] При использовании FISH любые изменения в хромосоме будут видны через несоответствия между флуоресцентно мечеными раковыми хромосомами и здоровыми хромосомами. [11] Результаты этих цитогенетических экспериментов могут пролить свет на генетические причины рака и могут обнаружить потенциальные терапевтические цели. [12]

Молекулярная цитогенетика также может использоваться в качестве диагностического инструмента для врожденных синдромов , при которых основные генетические причины заболевания неизвестны. [13] Анализ структуры хромосом пациента может выявить причинные изменения. Новые методы молекулярной биологии, разработанные за последние два десятилетия, такие как секвенирование следующего поколения и РНК-секвенирование, в значительной степени заменили молекулярную цитогенетику в диагностике, но в последнее время использование производных FISH, таких как многоцветный FISH и многоцветное бэндинг (mBAND), растет в медицинских приложениях. [14]

Проекты по борьбе с раком

Один из текущих проектов, связанных с молекулярной цитогенетикой, включает геномные исследования редких видов рака, называемые Инициативой по характеристике генома рака (Cancer Genome Characterization Initiative, CGCI). [15] CGCI — это группа, заинтересованная в описании генетических аномалий некоторых редких видов рака, используя передовое секвенирование геномов, экзомов и транскриптомов, которые в конечном итоге могут играть роль в патогенезе рака. [15] В настоящее время CGCI выявила некоторые ранее не определенные генетические изменения в медуллобластоме и В-клеточной неходжкинской лимфоме. Следующими шагами для CGCI является выявление геномных изменений в опухолях ВИЧ+ и в лимфоме Беркитта .

Некоторые высокопроизводительные методы секвенирования, используемые CGCI, включают: секвенирование всего генома , секвенирование транскриптома , ChIP-секвенирование и Illumina Infinum MethylationEPIC BeadCHIP. [16]

Ссылки

  1. ^ Kearney L, Horsley SW (сентябрь 2005 г.). «Молекулярная цитогенетика при гематологических злокачественных новообразованиях: современные технологии и будущие перспективы». Chromosoma . 114 (4): 286–94. doi :10.1007/s00412-005-0002-z. PMID  16003502. S2CID  19251871.
  2. ^ Bigner SH, Schröck E (ноябрь 1997 г.). «Молекулярная цитогенетика опухолей головного мозга». Журнал невропатологии и экспериментальной неврологии . 56 (11): 1173–81. doi : 10.1097/00005072-199711000-00001 . PMID  9370227.
  3. ^ О'Коннор С (2008). "Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)". Nature Education . 1 (1): 171.
  4. ^ Мартин EA, Макферран TA, ред. (2017). Словарь сестринского дела . Oxford University Press.
  5. ^ ab "Цитогенетическое тестирование | DermNet NZ". www.dermnetnz.org . Получено 2020-04-02 .
  6. ^ ab Banerjee D (15 января 2013 г.). Массивная сравнительная геномная гибридизация: протоколы и приложения . Нью-Йорк: Humana Press. С. 1–13.
  7. ^ Pinkel D, Albertson DG (2005). «Сравнительная геномная гибридизация». Annual Review of Genomics and Human Genetics . 6 (1): 331–54. doi :10.1146/annurev.genom.6.080604.162140. PMID  16124865.
  8. ^ Trask BJ (октябрь 2002 г.). «Человеческая цитогенетика: 46 хромосом, 46 лет и подсчет». Nature Reviews Genetics . 3 (10): 769–78. doi :10.1038/nrg905. PMID  12360235. S2CID  1127220.
  9. ^ Lucito R, Healy J, Alexander J, Reiner A, Esposito D, Chi M и др. (октябрь 2003 г.). «Репрезентативный анализ микроматриц олигонуклеотидов: метод высокого разрешения для обнаружения вариаций числа копий генома». Genome Research . 13 (10): 2291–305. doi : 10.1101/gr.1349003 . PMC 403708 . PMID  12975311. 
  10. ^ Robson SC, Chitty LS, Morris S, Verhoef T, Ambler G, Wellesley DG, Graham R, Leader C, Fisher J, Crolla JA (февраль 2017 г.). «Оценка сравнительной геномной гибридизации массива в пренатальной диагностике аномалий плода: многоцентровое когортное исследование с анализом затрат и оценкой предпочтений пациента, медицинского работника и уполномоченного по сравнительной геномной гибридизации массива». Оценка эффективности и механизма . 4 (1): 1–104. doi : 10.3310/eme04010 . PMID  28182369.
  11. ^ ab Rao PH, Nandula SV, Murty VV (2007). "Молекулярно-цитогенетическое применение в анализе генома рака". В Fisher PB (ред.). Геномика и протеомика рака: методы и протоколы . Методы в молекулярной биологии. Т. 383. Humana Press. стр. 165–85. doi :10.1007/978-1-59745-335-6_11. ISBN 9781597453356. PMID  18217685.
  12. ^ Wan TS (2017). "Цитогенетика рака: Введение". В Wan TS (ред.). Цитогенетика рака . Методы в молекулярной биологии. Т. 1541. Springer New York. С. 1–10. doi :10.1007/978-1-4939-6703-2_1. ISBN 9781493967018. PMID  27910009.
  13. ^ Speicher MR, Carter NP (октябрь 2005 г.). «Новая цитогенетика: размывание границ с молекулярной биологией». Nature Reviews Genetics . 6 (10): 782–92. doi :10.1038/nrg1692. PMID  16145555. S2CID  15023775.
  14. ^ Balajee AS, Hande MP (декабрь 2018 г.). «История и эволюция цитогенетических методов: текущие и будущие применения в фундаментальных и клинических исследованиях». Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis . В память о профессоре Адаяпаламе Т. Натараджане. 836 (Pt A): 3–12. doi : 10.1016/j.mrgentox.2018.08.008 . PMID  30389159. S2CID  53274124.
  15. ^ ab GenomeOC (2013-01-18). "Инициатива по характеристике генома рака". Office of Cancer Genomics . Получено 2019-10-05 .
  16. ^ "GenomeOC Research". Office of Cancer Genomics . 2013-02-04 . Получено 2019-10-05 .
  • Ресурсы цитогенетики
  • Цитогенетика человека - хромосомы и кариотипы
  • Ассоциация генетических технологов
  • Ассоциация клинических цитогенетиков
  • Цитогенетика - Технологии, рынки и компании
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Молекулярная_цитогенетика&oldid=1232766033"