маркировка MS2
Лабораторная техника

Маркировка MS2 — это метод, основанный на естественном взаимодействии белка оболочки бактериофага MS2 со структурой стебля-петли из генома фага , [1] который используется для биохимической очистки комплексов РНК-белок и в сочетании с GFP для обнаружения РНК в живых клетках. [2] В последнее время этот метод используется для мониторинга появления РНК в живых клетках, в месте транскрипции или просто путем наблюдения за изменениями количества РНК в цитоплазме. [3] [4] Это показало, что транскрипция как прокариотических, так и эукариотических генов происходит прерывистым образом со вспышками транскрипции, разделенными нерегулярными интервалами.

Процедура

Начните с одноцепочечной РНК и создайте шаблон структур «стебель-петля», добавив копии последовательностей связывания РНК MS2 в некодирующую область. [5] Белок MS2 должен быть слит с GFP и связан с мРНК, комплексом, который содержит копии последовательности связывания РНК MS2. [5] Белок слияния MS2-GFP был экспрессирован путем переноса его в клетку с плазмидой [5] (лаборатория Роберта Сингера). Сигнал, кодируемый внутри РНК, и присутствие сигнала ядерной локализации (NLS) внутри GFP-MS2 — это два сигнала, которые вводятся из комплексов EGFP-MS2-РНК. [6]

Аффинная очистка РНК, помеченной биотином MS2 (MS2-BioTRAP), является одним из методов in vivo идентификации взаимодействий белок-РНК. [7] Были экспрессированы как РНК, помеченная MS2, так и белковая метка MS2, а затем аффинное взаимодействие использовалось для облегчения процесса идентификации взаимодействий белок-РНК. [7]

Преимущества и недостатки

Преимущества:

Метод MS2-BioTRAP быстрый, гибкий и простой в настройке; он хорошо масштабируется и позволяет изучать физиологические условия взаимодействия белок-РНК. [7] Метка MS2 также эффективна для малых молекул, когда белок оболочки MS2 используется для выделения различных рибонуклеопротеиновых частиц (РНП) . [8]

Недостатки:

Одно предостережение относительно маркировки MS2 заключается в том, что необходимо добавить много копий стебель-петли MS2 внутри РНК, чтобы получить достаточно сигнала для просмотра и отслеживания одной молекулы РНК в ядре. [5] При отслеживании более чем одной последовательности РНК в ядре культивируемых клеток требуется более одной целевой последовательности. [5] На это может повлиять белок MS2, который имеет классический базовый сигнал ядерной локализации (NLS), поэтому он может повлиять на местоположение комплекса РНК, и ядро ​​будет иметь большую часть GFP-MS2 [5] (лаборатория Роберта Сингера). [6] Накопление GFP-MS2 в ядре приведет к сильным сигналам ядерной флуоресценции, что задержит или предотвратит анализ ядерной локализации РНК, поскольку это затруднит анализ сплайсинга, редактирования РНК, ядерного экспорта РНК и трансляции РНК. [6] Более того, из-за добавления метки вторичная структура РНК может внести артефакт. [5]

Кроме того, уровни экспрессии малых некодирующих РНК (мРНК) и регуляторные свойства будут зависеть от тега MS2. [8] Кроме того, используя MS2 в качестве аффинной метки для очистки белка в бактериях E. coli , ученые экспрессировали MS2-MBP, который представляет собой белок оболочки MS2, несущий мутации, слитые с белками, связывающими мальтозу . Мутации предотвращали олигомеризацию . [8]

Ссылки

  1. ^ Йоханссон Х. Э., Лильяс Л., Уленбек О. К. (1997). «Распознавание РНК белком оболочки фага MS2». Семинары по вирусологии . 8 (3): 176– 185. doi :10.1006/smvy.1997.0120.
  2. ^ Bertrand E, Chartrand P, Schaefer M, Shenoy SM, Singer RH, Long RM (октябрь 1998 г.). «Локализация частиц мРНК ASH1 в живых дрожжах». Molecular Cell . 2 (4): 437– 45. doi : 10.1016/s1097-2765(00)80143-4 . PMID  9809065.
  3. ^ Golding I, Paulsson J, Zawilski SM, Cox EC (декабрь 2005 г.). «Кинетика активности генов в реальном времени у отдельных бактерий». Cell . 123 (6): 1025–36 . doi : 10.1016/j.cell.2005.09.031 . PMID  16360033. S2CID  10319035.
  4. ^ Chubb JR, Trcek T, Shenoy SM, Singer RH (май 2006 г.). «Транскрипционная пульсация гена развития». Current Biology . 16 (10): 1018– 25. Bibcode : 2006CBio...16.1018C. doi : 10.1016/j.cub.2006.03.092. PMC 4764056. PMID  16713960 . 
  5. ^ abcdefg "Живой и в цвете | The Scientist Magazine®". The Scientist . Получено 2017-03-12 .
  6. ^ abc "Технология". Lucerna, Inc. Получено 2017-03-12 .
  7. ^ abc Marchese D, de Groot NS, Lorenzo Gotor N, Livi CM, Tartaglia GG (ноябрь 2016 г.). «Достижения в характеристике РНК-связывающих белков». Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA . 7 (6): 793– 810. doi :10.1002/wrna.1378. PMC 5113702. PMID  27503141 . 
  8. ^ abc Said N, Rieder R, Hurwitz R, Deckert J, Urlaub H, Vogel J (ноябрь 2009 г.). "In vivo экспрессия и очистка малых РНК-регуляторов с тегами аптамеров". Nucleic Acids Research . 37 (20): e133. doi :10.1093/nar/gkp719. PMC 2777422. PMID  19726584 . 
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=MS2_tagging&oldid=1254263747"