МИКЕ
Протоколы для отчетности экспериментов qPCR

Руководство по минимальной информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени ( MIQE ) представляет собой набор протоколов для проведения и представления количественных экспериментов и данных ПЦР в реальном времени , разработанных Бастином и др. в 2009 году. [1] Они были разработаны после публикации статьи в 2002 году, в которой утверждалось, что вирус кори можно обнаружить у детей с аутизмом с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени, но результаты оказались совершенно невоспроизводимыми другими учеными. [2] Сами авторы также не пытались их воспроизвести, и было обнаружено, что исходные данные содержат большое количество ошибок и элементарных ошибок в анализе. Этот инцидент побудил Стивена Бастина создать руководство MIQE, чтобы обеспечить базовый уровень качества для данных ПЦР в реальном времени, опубликованных в научной литературе. [2]

Цель

Руководящие принципы MIQE были созданы из-за низкого качества данных qPCR, представленных в академические журналы в то время, что становилось все более распространенным, поскольку оборудование для секвенирования следующего поколения позволяло проводить такие эксперименты по более низкой стоимости. Поскольку эта техника используется во всех областях науки, инструменты, методы и конструкции того, как используется qPCR, сильно различаются. Чтобы помочь улучшить общее качество, руководящие принципы MIQE были сделаны как обобщенные предложения по основным экспериментальным процедурам и формам данных, которые должны быть собраны в качестве минимального уровня сообщаемой информации для других исследователей, чтобы понять и использовать при чтении опубликованных материалов. Создание признанного и в значительной степени согласованного набора руководящих принципов, таких как эти, было сочтено важным научным сообществом, особенно из-за постоянно растущего объема научной работы, поступающей из развивающихся стран с множеством разных языков и протоколов. [3]

История

Первоначальные версии развития

В 2009 году Стивен Бастин возглавил международную группу ученых, включая Микаэля Кубиста, для составления набора руководств о том, как выполнять qPCR и какие формы данных следует собирать и публиковать в этом процессе. [1] Это также позволило редакторам и рецензентам научных журналов использовать руководящие принципы при просмотре представленных статей, содержащих данные qPCR. Таким образом, руководящие принципы были составлены как своего рода контрольный список для каждого шага процедуры, при этом некоторые пункты были отмечены как необходимые (E) при отправке данных для публикации, а другие были отмечены как просто желательные (D). [4]

Дополнительная версия руководств была опубликована в сентябре 2010 года для использования с количественной ПЦР в реальном времени на основе флуоресценции. Она также служила кратким изложением более широкой формы руководств. [5] Другие исследователи создавали дополнительные версии для определенных форм ПЦР в реальном времени, которые могут потребовать дополнительного или другого набора элементов для проверки, включая ПЦР в реальном времени для отдельных клеток [6] и цифровую ПЦР (dPCR). [7] Соответствующее соблюдение существующих руководств MIQE также было рассмотрено в других научных областях, включая фотобиомодуляцию [8] и клинические биомаркеры . [9]

Бастин отметил в 2014 году (и снова им в 2017 году), что в научном сообществе наблюдалось некоторое усвоение и использование руководств MIQE, но все еще было слишком много опубликованных статей с экспериментами qPCR, в которых отсутствовало даже самое базовое представление данных и надлежащее подтверждение эффективности указанных данных. Эти исследования сохраняли серьезные проблемы с воспроизводимостью, когда выводы их доказательств не могли быть воспроизведены другими исследователями, что ставило под сомнение первоначальные результаты. Все это происходило несмотря на то, что многие статьи напрямую ссылались на оригинальную публикацию Бастина MIQE, но не следовали контрольному списку материалов руководства в своих собственных экспериментах. [2] [10] Однако некоторые исследователи указали по крайней мере на некоторый успех, при этом ряд статей были отклонены академическими журналами для публикации из-за несоответствия контрольным спискам MIQE. Другие исследования были отозваны постфактум, как только было отмечено отсутствие у них надлежащих данных для соответствия руководящим принципам MIQE и публично указано редакторам журнала. [11]

Ужесточение правил

При настройке своих новых сравнительных систем ПЦР под названием «Точки в коробках» в 2017 году компания New England Biolabs заявила, что они разработали часть сбора данных на основе руководств MIQE, чтобы данные соответствовали всем минимальным контрольным спискам параметров в протоколах. [12] Другие компании, производящие научные приборы, помогли в соблюдении руководств, целенаправленно адаптировав свои устройства под них, включая компанию Bio-Rad, создавшую мобильное приложение , которое позволяет активно отмечать контрольный список MIQE по мере завершения каждого шага. [13]

Обзор 10-й годовщины с момента публикации руководящих принципов MIQE был проведен в июне 2020 года и обсудил научные исследования, которые дали лучшие и более организованные результаты при следовании руководящим принципам. [14] В августе 2020 года была опубликована обновленная версия руководящих принципов для метода цифровой ПЦР, чтобы учесть улучшение оборудования, технологий и методик с момента первоначального выпуска 2013 года. Были добавлены дополнительные шаги руководства для анализа данных, а также предоставлена ​​более упрощенная таблица контрольного списка для использования исследователями. [15] Анализ таргетинга ОТ-кПЦР был разработан совместно со Стивеном Бастином с использованием руководящих принципов MIQE для клинических биомаркеров в декабре 2020 года с целью выявления клинического присутствия вирусных частиц COVID-19 во время пандемии COVID-19 . [16]

Обзор руководящих принципов

Руководящие принципы MIQE разделены на 9 различных разделов, которые составляют контрольный список. Они включают не только соображения по проведению самого qPCR, но и то, как собираются, анализируются и представляются полученные данные. Важной частью последнего является включение информации, касающейся используемого программного обеспечения для анализа, а также отправка необработанных данных в соответствующие базы данных. [1]

Экспериментальный дизайн

Большая часть руководств включает основные действия, которые обычно включаются в эксперименты и публикации независимо, например, пункт для описания различий экспериментальной и контрольной групп. Другая подобная информация включает, сколько отдельных единиц используется в каждой группе в эксперименте. Эти две части определены как необходимые для любого исследования. Этот раздел также включает два желательных пункта, которые указывают, была ли лаборатория автора сама или основная лаборатория университета или организации провела анализ qPCR, и признание любых других лиц, которые внесли свой вклад в работу. [1]

Образец

Основные требования, которым должны соответствовать образцы и материал образцов, включают описание образца, какая форма препарирования использовалась, какой метод обработки был применен, были ли образцы заморожены или зафиксированы и сколько времени это заняло, и какие условия образцов использовались. Также желательно знать объем или массу образца, который был обработан для qPCR. [1]

Извлечение нуклеиновых кислот

Для процесса извлечения ДНК/РНК существует ряд важных руководств. Они включают описание проведенного процесса извлечения, заявление о том, какой набор для извлечения ДНК использовался и любые изменения, внесенные в инструкции, подробности о том, использовалась ли какая-либо обработка ДНКазой или РНКазой , заявление о том, оценивалось ли какое-либо загрязнение, количественная оценка количества извлеченного генетического материала, описание инструментов, используемых для извлечения, методы, используемые для сохранения целостности РНК, заявление о числе целостности РНК и индикаторе качества, а также достигнутом цикле количественной оценки (Cq), и, наконец, какие испытания проводились для определения наличия или отсутствия ингибиторов . Четыре желаемых фрагмента информации — откуда были получены используемые реагенты, какой уровень генетической чистоты был получен, какой был получен выход и изображение электрофорезного геля для подтверждения. [1]

Обратная транскрипция

Основные существенные части для этой фазы включают в себя подробное описание условий реакции в полном объеме, предоставление как количества использованной РНК, так и общего объема реакции, предоставление информации об олигонуклеотиде , использованном в качестве праймера, и его концентрации, концентрации и типе использованной обратной транскриптазы , и, наконец, температуре и количестве времени, проведенном для реакции. Желательно также иметь каталожные номера использованных реагентов и их производителей, стандартное отклонение для Cq с участием и без участия транскриптазы, и то, как хранилась кДНК . [1]

Целевая информация qPCR

Здесь необходима вся основная информация о цели, включая символ гена, номер базы данных для рассматриваемой последовательности, длину амплифицируемой последовательности, информацию об используемом скрининге специфичности, таком как BLAST , какие варианты сплайсинга существуют для последовательности и где находится экзон или интрон для каждого праймера. Для этого раздела есть несколько желаемых, но не обязательных частей информации, таких как местоположение ампликона , существуют ли какие-либо псевдогены или гомологи , было ли выполнено выравнивание последовательности и какие данные были получены из него, а также любые данные о вторичной структуре амплифицированной последовательности. [1]

олигонуклеотиды qPCR

Создание олигонуклеотидов требует только двух частей необходимой информации: последовательности используемых праймеров и местоположение и подробности любых изменений, внесенных в последовательность. Но есть несколько желательных частей данных, включая идентификационный номер из базы данных RTPrimerDB, последовательности из зондов , производителя, использованного для создания олигонуклеотидов, и то, как они были очищены. [1]

протокол ПЦР

В качестве одного из основных сегментов руководства, в контрольном списке для самого процесса qPCR есть несколько важных частей. Это включает в себя полный набор условий, используемых для реакции, объем как реакции, так и кДНК, концентрации зондов, ионов магния и dNTP , какой тип полимеразы использовался и ее концентрация, какой набор использовался и его производитель, какие добавки к реакции использовались, кто изготовил машину qPCR и какие параметры были установлены для процесса термоциклирования . Единственными дополнительными желаемыми частями информации являются химический состав используемого буфера, кто изготовил используемые планшеты и пробирки и каков их каталожный номер, и была ли реакция настроена вручную или с помощью машины. [1] [17]

проверка методом ПЦР

Для подтверждения эффективности и качества выполненного процесса qPCR необходимо выполнить несколько действий и предоставить последующие данные. Это включает в себя объяснение конкретного метода проверки того, что процесс функционировал, например, с использованием геля, прямого секвенирования генетического материала, отображения профиля плавления или переваривания рестриктазой . Если использовался SYBR Green I , то необходимо указать Cq контрольной группы без шаблона ДНК. Дополнительные важные данные включают калибровку кривых машины с отмеченным наклоном и y-пересечением, эффективность процесса ПЦР, определенную по вышеупомянутому наклону, коэффициенты корреляции (r в квадрате) для калибровочных кривых, динамический диапазон линейных кривых, Cq, найденный при самой низкой концентрации, где 95% результатов все еще были положительными (LOD), вместе с доказательствами самого LOD, и, наконец, если используется мультиплекс , то необходимо указать эффективность и LOD для каждого выполненного анализа. [1] [17]

Дополнительная желаемая информация включает в себя доказательства того, что оптимизация qPCR произошла с использованием градиентов, доверительные интервалы для демонстрации эффективности qPCR и доверительные интервалы для всего протестированного диапазона. [1]

Анализ данных

Заключительный раздел руководства содержит информацию о том, как был выполнен анализ данных qPCR. Основные части этого включают программу и версию программы, использованную для анализа, метод определения Cq, выяснение точек выброса в данных и того, как они используются или исключаются и почему, какие результаты были получены для контролей без шаблонного генетического материала, объяснение того, почему были выбраны референтные гены и почему было выбрано их количество, метод, использованный для нормализации данных, сколько технических повторов было включено, насколько повторяемыми были данные в анализах, какие методы использовались для определения значимости результатов и какое программное обеспечение использовалось для этой части качественного анализа. [1]

Также желательно включить информацию о количестве биологических повторов и о том, соответствуют ли они результатам технических повторов, данные о воспроизводимости для вариантов концентрации, данные об анализе мощности и, наконец, для исследователей, чтобы они представили необработанные данные в формате файла RDML. [1] [18]

Ссылки

  1. ^ abcdefghijklmn Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT (апрель 2009 г.). «Руководящие принципы MIQE: минимальная информация для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени». Клиническая химия . 55 (4): 611– 622. doi : 10.1373/clinchem.2008.112797 . PMID  19246619.
  2. ^ abc Bustin SA (декабрь 2014 г.). «Воспроизводимость биомедицинских исследований: спящие просыпаются!». Biomolecular Detection and Quantification . 2 : 35– 42. doi : 10.1016 /j.bdq.2015.01.002. PMC 5121206. PMID  27896142. 
  3. ^ Абдель Нур AM, Азхар E, Даманхури G, Бастин SA (февраль 2014 г.). «Пятилетние руководящие принципы MIQE: случай арабских стран». PLOS One . 9 (2): e88266. Bibcode : 2014PLoSO...988266A. doi : 10.1371/journal.pone.0088266 . PMC 3913779. PMID  24505456 . 
  4. ^ Фаррелл, Роберт Э. (август 2017 г.). «Руководство MIQE». Методологии РНК: лабораторное руководство по выделению и характеристике. Academic Press . стр.  287–288 . ISBN 978-0128046791.
  5. ^ Bustin SA, Beaulieu JF, Huggett J, Jaggi R, Kibenge FS, Olsvik PA, Penning LC, Toegel S (сентябрь 2010 г.). "MIQE précis: Practical Implementation of Minimum Standard Guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experimentals". BMC Molecular Biology . 11 : 74. doi : 10.1186/1471-2199-11-74 . PMC 2955025. PMID  20858237 . 
  6. ^ Stahlberg A, Kubista M (февраль 2018). «Технические аспекты и рекомендации для одноклеточной ПЦР». Молекулярные аспекты медицины . 59 : 28–35 . doi :10.1016/j.mam.2017.07.004. PMID  28756182.
  7. ^ Huggett JF, Foy CA, Benes V, Emslie K, Garson JA, Haynes R, Hellemans J, Kubista M, Mueller RD, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT, Bustin SA (июнь 2013 г.). «Руководящие принципы цифрового MIQE: минимальная информация для публикации количественных цифровых экспериментов ПЦР». Клиническая химия . 59 (6): 892–902 . doi : 10.1373/clinchem.2013.206375 . PMID  23570709.
  8. ^ Houreld NN (февраль 2017 г.). «Соблюдаются ли рекомендации MIQE при исследованиях методом ПЦР в экспериментах по фотобиомодуляции?». Фотомедицина и лазерная хирургия . 35 (2): 69–70 . doi :10.1089/pho.2016.4220. PMID  28056213.
  9. ^ Ридмайер И, Шпорнрафт М, Кирхнер Б, Пфаффл МВ (январь 2016 г.). «Соответствие MIQE при профилировании экспрессии и открытии клинических биомаркеров». European Pharmaceutical Review . 20 (6): 32–36 . Получено 13 июня 2019 г.
  10. ^ Bustin SA, Nolan T (август 2017 г.). «Говорим о вещах, но не делаем дел: ОТ-ПЦР как парадигма отсутствия воспроизводимости в молекулярных исследованиях». European Journal of Clinical Investigation . 47 (10): 756–774 . doi : 10.1111/eci.12801 . PMID  28796277.
  11. ^ Taylor SC, Laperriere G, Germain H (май 2017 г.). «Цифровая ПЦР с каплями и кПЦР для анализа экспрессии генов с малочисленными мишенями: от вариабельной бессмыслицы до данных о качестве публикации». Scientific Reports . 7 (1): 2409. Bibcode :2017NatSR...7.2409T. doi :10.1038/s41598-017-02217-x. PMC 5445070 . PMID  28546538. 
  12. ^ Марусина, Кейт (1 октября 2017 г.). «Позиционирование цифровой ПЦР для более четкого изображения генома». Новости генной инженерии и биотехнологии . Получено 8 июня 2019 г.
  13. ^ Perkel J (май 2015). «Руководство нашими экспериментами ПЦР». BioTechniques . 58 (5): 217– 221. doi : 10.2144/000114283 . PMID  25967899.
  14. ^ Nour A, Nerner G, Khalil A (июнь 2020 г.). «Десятая годовщина Руководства MIQE: хорошие и плохие студенты». Gene Reports . 19 : 100630. doi : 10.1016/j.genrep.2020.100630. S2CID  212994609. Получено 12 февраля 2021 г.
  15. ^ Группа dMIQE (август 2020 г.). «Обновление руководств по цифровому MIQE: минимальная информация для публикации количественных экспериментов цифровой ПЦР в 2020 г.». Клиническая химия . 66 (8): 1012–1029 . doi : 10.1093/clinchem/hvaa125 . hdl : 1854/LU-8688167 . PMID  32746458. Получено 12 февраля 2021 г.
  16. ^ Bustin S, Coward A, Sadler G, Teare L, Nolan T (17 декабря 2020 г.). "CoV2-ID, MIQE-совместимый суб-20-минутный 5-плексный ОТ-ПЦР-анализ, нацеленный на SARS-CoV-2 для диагностики COVID-19". Scientific Reports . 10 (1): 22214. Bibcode :2020NatSR..1022214B. doi : 10.1038/s41598-020-79233-x . PMC 7747624 . PMID  33335187. 
  17. ^ ab Birnie, Andrew (14 мая 2015 г.). «Влияние новых технологий на соблюдение рекомендаций MIQE». Новости генной инженерии и биотехнологии . Получено 13 июня 2019 г.
  18. ^ Руйтер Дж. М., Лефевер С., Анкарт Дж., Хеллеманс Дж., Пфаффл М.В., Бенеш В., Бустин С.А., Вандесомпель Дж., Унтергассер А. (июнь 2015 г.). «RDML-Ninja и RDMLdb для стандартизированного обмена данными qPCR». БМК Биоинформатика . 16 (197): 197. дои : 10.1186/s12859-015-0637-6 . ПМЦ 4474546 . ПМИД  26087842. 

Дальнейшее чтение

  • Шипли, Грег (2011). «Руководство MIQE раскрыто». В Кеннеди, Сюзанна; Освальд, Ник (ред.). Устранение неполадок и оптимизация ПЦР: основное руководство. Horizon Scientific Press . стр.  151–166 . ISBN 978-1904455721.
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=MIQE&oldid=1233500184"