Изотопно-кодированная аффинная метка
Изотопно -кодированная аффинная метка ( ICAT ) — это метод изотопной маркировки in vitro, используемый для количественной протеомики с помощью масс-спектрометрии , в котором используются химические реагенты для маркировки. [1] [2] [3] Эти химические зонды состоят из трех элементов: реактивной группы для маркировки боковой цепи аминокислоты (например, иодацетамида для модификации остатков цистеина ), изотопно-кодированного линкера и метки (например, биотина ) для аффинной изоляции меченых белков/пептидов. Образцы объединяются, а затем разделяются с помощью хроматографии, затем отправляются через масс-спектрометр для определения соотношения массы к заряду между белками. Можно анализировать только пептиды, содержащие цистеин. Поскольку анализируются только пептиды, содержащие цистеин, часто посттрансляционная модификация теряется. [4]
Разработка
Первоначальные метки были разработаны с использованием дейтерия , но позже та же группа переработала метки, используя вместо этого 13C , чтобы обойти проблемы разделения пиков во время жидкостной хроматографии из-за взаимодействия дейтерия с неподвижной фазой колонки. [5]
Количественная протеомика
Для количественного сравнения двух протеомов один образец маркируется изотопно-легким (d0) зондом, а другой — изотопно-тяжелым (d8) вариантом. Чтобы свести к минимуму ошибку, оба образца затем объединяются, расщепляются протеазой ( т. е. трипсином ) и подвергаются аффинной хроматографии с авидином для выделения пептидов, маркированных изотопно-кодированными реагентами для маркировки. Затем эти пептиды анализируются методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЖХ-МС). Соотношения интенсивностей сигналов дифференциально-масс-меченых пар пептидов количественно определяются для определения относительных уровней белков в двух образцах.
Ссылки
- ^ Коланджело, Кристофер М.; Уильямс, Кеннет Р. (2006). «Изотопно-кодированные метки аффинности для количественной оценки белков». Новые и развивающиеся протеомные методы . Методы в молекулярной биологии. Т. 328. С. 151–158. doi :10.1385/1-59745-026-X:151. ISBN 978-1-59745-026-3. PMID 16785647.
- ^ Gygi SP, Rist B, Gerber SA, Turecek F, Gelb MH, Aebersold R (октябрь 1999 г.). «Количественный анализ сложных белковых смесей с использованием изотопно-кодированных аффинных меток». Nature Biotechnology . 17 (10): 994–9. doi :10.1038/13690. PMID 10504701.
- ^ US 6670194, Aebersold, Rudolf Hans; Gelb, Michael H. & Gygi, Steven P. et al., «Быстрый количественный анализ белков или функций белков в сложных смесях», опубликовано 2003-12-30, передано в Университет Вашингтона
- ^ "iCAT". Протеомика . Получено 2020-06-07 .
- ^ Yi, EC; et al. (2005). «Увеличение количественного покрытия протеома с помощью реагента аффинной метки на основе (13)C/(12)C, расщепляемого кислотой изотопного кода, и модифицированной схемы получения данных». Proteomics . 5 (2): 380–7. doi :10.1002/pmic.200400970. PMID 15648049.
