Интерференционная отражательная микроскопия
Принцип интерференционной отражательной микроскопии (IRM)
Принцип интерференционной отражательной микроскопии (IRM), показывающий эффект интерференции на отраженных волнах и результат на интенсивности конечного изображения. Темно-фиолетовая волна представляет свет от источника света. Светло-фиолетовые волны являются отражениями от клеточной мембраны и от поверхности стекла. При попадании на поверхность стекла отраженные волны смещаются на половину длины волны. Когда мембрана находится очень близко к стеклу, отраженный свет будет отражаться в противофазе с отраженным лучом от стекла. Это вызовет деструктивную интерференцию (см. красную линию), что приведет к темному пикселю. Если расстояние между мембраной и стеклом больше, возвращающиеся волны будут смещены меньше и вызовут конструктивную интерференцию (см. красную линию), что приведет к более яркому пикселю на конечном изображении. Указаны типичные показатели преломления стекла, среды и клеточной мембраны, которые определяют величину отражения.

Интерференционная отражательная микроскопия ( IRM ), также называемая отражательной интерференционной контрастной микроскопией ( RICM ) или отражательной контрастной микроскопией ( RCM ) в зависимости от конкретных используемых оптических элементов, представляет собой метод оптической микроскопии , который использует эффекты интерференции тонкой пленки для формирования изображения объекта на стеклянной поверхности. Интенсивность сигнала является мерой близости объекта к стеклянной поверхности. Этот метод может использоваться для изучения событий на клеточной мембране без использования (флуоресцентной) метки, как в случае с TIRF-микроскопией .

История и название

В 1964 году Адам С. Г. Кертис ввел термин «интерференционная отражательная микроскопия» ( IRM ), используя его в области клеточной биологии для изучения фибробластов эмбрионального сердца цыпленка. [1] [2] Он использовал IRM для изучения мест адгезии и расстояний между фибробластами, отметив, что контакт со стеклом в основном ограничивался периферией клетки и псевдоподиями . [1]

В 1975 году Йохан Себастьян Плоем представил усовершенствование IRM (опубликованное в главе книги [3] ), которое он назвал отражательной контрастной микроскопией ( RCM ). [4] Усовершенствование заключается в использовании так называемого анти-гибкого объектива и скрещенных поляризаторов для дальнейшего уменьшения рассеянного света в оптической системе. Сегодня эта схема в основном называется отражательной интерференционной контрастной микроскопией ( RICM ), [5] [6] название которой было введено Барейтером-Ханом и Конрадом Беком в 1979 году. [7]

Однако термин IRM иногда используется для описания установки RICM. Множественность названий, используемых для описания техники, вызвала некоторую путаницу и обсуждалась еще в 1985 году Вершуэреном. [8]

Теория

Для формирования изображения прикрепленной клетки свет определенной длины волны пропускается через поляризатор . Этот линейно поляризованный свет отражается светоделителем в направлении объектива , который фокусирует свет на образце. Стеклянная поверхность в определенной степени отражает и будет отражать поляризованный свет. Свет, который не отражается стеклом, будет попадать в клетку и отражаться клеточной мембраной. Могут возникнуть три ситуации. Во-первых, когда мембрана находится близко к стеклу, отраженный от стекла свет смещается на половину длины волны, так что свет, отраженный от мембраны, будет иметь фазовый сдвиг по сравнению с отраженным светом от фаз стекла и, следовательно, компенсируют друг друга ( интерференция ). Эта интерференция приводит к появлению темного пикселя на конечном изображении (левый случай на рисунке). Во-вторых, когда мембрана не прикреплена к стеклу, отражение от мембраны имеет меньший фазовый сдвиг по сравнению с отраженным светом от стекла, и, следовательно, они не будут компенсировать друг друга, что приводит к появлению яркого пикселя на изображении (правый случай на рисунке). В-третьих, при отсутствии образца регистрируется только отраженный от стекла свет, который на конечном изображении отображается в виде ярких пикселей.

Отраженный свет вернется к светоделителю и пройдет через второй поляризатор, который устраняет рассеянный свет, прежде чем достичь детектора (обычно это ПЗС-камера ) для формирования окончательного изображения. Поляризаторы могут повысить эффективность за счет уменьшения рассеянного света; однако в современной установке с чувствительной цифровой камерой они не требуются. [9]

Теория

Отражение вызвано изменением показателя преломления, поэтому на каждой границе часть света будет отражаться. Величина отражения определяется коэффициентом отражения , согласно следующему правилу: [8] г 12 {\displaystyle r_{12}\!}

г 12 = н 1 − н 2 н 1 + н 2 {\displaystyle r_{12}={\frac {n_{1}-n_{2}}{n_{1}+n_{2}}}}

Отражательная способность – это отношение интенсивности отраженного света ( ) к интенсивности входящего света ( ): [8] Р {\displaystyle Р\!} я г {\displaystyle Я_{г}\!} я я {\displaystyle Я_{я}\!}

Р = я г я я = [ н 1 − н 2 н 1 + н 2 ] 2 = г 12 2 {\displaystyle R={\frac {I_{r}}{I_{i}}}=\left\lbrack {\frac {n_{1}-n_{2}}{n_{1}+n_{2}}}\right\rbrack ^{2}={r_{12}}^{2}}

Используя типичные показатели преломления для стекла (1,50–1,54, см. список ), воды (1,31, см. список ), клеточной мембраны (1,48) [10] и цитозоля (1,35), [10] можно рассчитать долю света, отраженного каждым интерфейсом. Величина отражения увеличивается по мере увеличения разницы между показателями преломления, что приводит к большому отражению от интерфейса между поверхностью стекла и культуральной средой (примерно равному воде: 1,31–1,33). Это означает, что без клетки изображение будет ярким, тогда как при прикреплении клетки разница между средой и мембраной вызывает большое отражение, которое слегка смещено по фазе, вызывая интерференцию со светом, отраженным стеклом. Поскольку амплитуда света, отраженного от интерфейса среда-мембрана, уменьшается из-за рассеяния, прикрепленная область будет казаться темнее, но не полностью черной. Поскольку конус света, сфокусированный на образце, приводит к появлению различных углов падающего света, существует широкий диапазон интерференционных картин. Когда узоры отличаются менее чем на 1 длину волны (полоса нулевого порядка), узоры сходятся, что приводит к увеличению интенсивности. Этого можно добиться, используя объектив с числовой апертурой больше 1. [8]

Требования

Для получения изображений клеток с помощью ИРМ микроскопу необходимы как минимум следующие элементы: 1) источник света, например галогенная лампа, 2) оптический фильтр (пропускающий небольшой диапазон длин волн) и 3) светоделитель (отражающий 50% и пропускающий 50% выбранной длины волны).

Источник света должен производить свет высокой интенсивности, так как много света будет теряться расщепителем луча и самим образцом. Различные длины волн приводят к различным изображениям IRM; Берейтер-Хан и его коллеги показали, что для их клеток PtK 2 свет с длиной волны 546 нм давал лучший контраст, чем синий свет с длиной волны 436 нм. [7] Было сделано много уточнений в базовой теории IRM, большинство из которых повышают эффективность и выход формирования изображения. Размещая поляризаторы и четвертьволновую пластину между расщепителем луча и образцом, линейно поляризованный свет можно преобразовать в круговой поляризованный свет , а затем преобразовать обратно в линейный поляризованный свет, что повышает эффективность системы. В статье о круговом поляризаторе этот процесс обсуждается подробно. Кроме того, включив второй поляризатор, который повернут на 90° по сравнению с первым поляризатором, можно предотвратить попадание рассеянного света на детектор, что увеличивает отношение сигнал/шум (см. Рисунок 2 Verschueren [8] ).

Биологическое применение

Существует несколько способов использования IRM для изучения биологических образцов. Ранние примеры использования этой техники были сосредоточены на адгезии клеток [1] ​​и миграции клеток . [11]

Слияние везикул

Две хромаффинные клетки, полученные с помощью DIC (слева) и IRM (справа).
Слияние везикул визуализировано с помощью IRM. Масштабная линейка представляет 2 мкм.

Совсем недавно эта техника была использована для изучения экзоцитоза в хромаффинных клетках . [9] При визуализации с использованием DIC хромаффинные клетки выглядят как круглые клетки с небольшими выступами. Когда та же клетка визуализируется с использованием IRM, отпечаток клетки на стекле можно четко увидеть как темную область с небольшими выступами. Когда везикулы сливаются с мембраной, они выглядят как маленькие светлые круги внутри темного отпечатка (яркие пятна в верхней клетке на правой панели).

Пример слияния везикул в хромаффинных клетках с использованием IRM показан в фильме 1. При стимуляции 60  мМ калия внутри темного следа хромаффинной клетки начинают появляться множественные яркие пятна в результате экзоцитоза плотных ядерных гранул. Поскольку IRM не требует флуоресцентной метки, ее можно комбинировать с другими методами визуализации, такими как эпифлуоресценция и TIRF-микроскопия, для изучения динамики белка вместе с экзоцитозом и эндоцитозом везикул. Еще одним преимуществом отсутствия флуоресцентных меток является снижение фототоксичности .

Ссылки

  1. ^ abc Curtis AS (февраль 1964). "МЕХАНИЗМ АДГЕЗИИ КЛЕТОК К СТЕКЛУ: исследование с помощью интерференционной отражательной микроскопии". Журнал клеточной биологии . 20 (2): 199– 215. doi :10.1083/jcb.20.2.199. PMC  2106393. PMID  14126869 .
  2. ^ Filler TJ, Peuker ET (апрель 2000 г.). «Отражательно-контрастная микроскопия (RCM): забытая техника?». Журнал патологии . 190 (5): 635– 8. doi :10.1002/(SICI)1096-9896(200004)190:5<635::AID-PATH571>3.0.CO;2-E. PMID  10727991. S2CID  43800311.
  3. ^ Фурс, Ральф ван (1975). "Глава 27: Отражательно-контрастная микроскопия как инструмент для исследования прикрепления живых клеток к стеклянной поверхности". Мононуклеарные фагоциты: в иммунитете, инфекции и патологии . Оксфорд: Blackwell Scientific. стр.  405–421 . ISBN 0-632-00471-1. OCLC  2701405.
  4. ^ Ploem, Johan Sebastiaan (2019-02-21). «Применение отражательно-контрастной микроскопии, включая чувствительное обнаружение результатов гибридизации in situ, обзор». Журнал микроскопии . 274 (2). Wiley: 79– 86. doi : 10.1111/jmi.12785. ISSN  0022-2720. PMID  30720204. S2CID  73431526.
  5. ^ Theodoly, O.; Huang, Z.-H.; Valignat, M.-P. (2009-11-30). "Новое моделирование отражательной интерференционной контрастной микроскопии, включая эффекты поляризации и числовой апертуры: применение к измерениям нанометрических расстояний и реконструкции профиля объекта" (PDF) . Langmuir . 26 (3). Американское химическое общество (ACS): 1940–1948 . doi :10.1021/la902504y. ISSN  0743-7463. PMID  19947618.
  6. ^ Лимозин, Лоран; Сенгупта, Хейя (2009-11-03). «Количественная отражательная интерференционная контрастная микроскопия (RICM) в мягких веществах и клеточной адгезии». ChemPhysChem . 10 (16). Wiley: 2752– 2768. doi :10.1002/cphc.200900601. ISSN  1439-4235.
  7. ^ ab Bereiter-Hahn J, Fox CH, Thorell B (сентябрь 1979 г.). «Количественная отражательная контрастная микроскопия живых клеток». The Journal of Cell Biology . 82 (3): 767– 79. doi :10.1083/jcb.82.3.767. PMC 2110483. PMID  389938 . 
  8. ^ abcde Verschueren H (апрель 1985). «Микроскопия интерференционного отражения в клеточной биологии: методология и применение». Journal of Cell Science . 75 (1): 279– 301. doi :10.1242/jcs.75.1.279. PMID  3900106.
  9. ^ ab Wu MM, Llobet A, Lagnado L (ноябрь 2009 г.). «Слабая связь между кальциевыми каналами и участками экзоцитоза в хромаффинных клетках». Журнал физиологии . 587 (Pt 22): 5377– 91. doi : 10.1113 /jphysiol.2009.176065. PMC 2793871. PMID  19752110. 
  10. ^ ab Dunn, Andrew Kenneth (1997). "Структура клетки". Свойства рассеяния света клетками (диссертация). Техасский университет в Остине . OCLC  39949488. Получено 23 февраля 2010 г.
  11. ^ Godwin SL, Fletcher M, Burchard RP (сентябрь 1989 г.). «Исследование интерференционной отражательной микроскопии участков ассоциации между скользящими бактериями и стеклянными субстратами». Журнал бактериологии . 171 (9): 4589– 94. doi : 10.1128 /jb.171.9.4589-4594.1989. PMC 210255. PMID  2768185. 

Дальнейшее чтение

  • Лимозин, Лоран; Сенгупта, Хейя (2009-11-09). «Количественная отражательная интерференционная контрастная микроскопия (RICM) в мягких веществах и клеточной адгезии». ChemPhysChem . 10 (16): 2752– 2768. doi :10.1002/cphc.200900601. ISSN  1439-4235.
  • Медицинский колледж Альберта Эйнштейна по IRM
  • Отражённая конфокальная микроскопия на Nikon MicroscopyU
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Interference_reflection_microscopy&oldid=1253356249"