Тестирование мышц in vitro

Тестирование живой мышечной ткани вне организма

In vitro мышечное тестирование — это метод, используемый для характеристики свойств живой мышечной ткани после ее извлечения из организма, что позволяет более обширно и точно количественно оценить ее свойства, чем in vivo тестирование. In vitro мышечное тестирование предоставило большую часть научных знаний о структуре и физиологии мышц, а также о том, как они связаны с производительностью организма. Исследования стволовых клеток опираются на in vitro мышечное тестирование для установления единственной функции мышечной клетки и ее индивидуального поведения отдельно от мышечных клеток в присутствии немышечных клеток, наблюдаемых висследованиях in vitro . ^[1]

Изоляция ткани

После выбора подходящего животного — будь то для определенной локомоторной функции (например, лягушки для прыжков); или определенного штамма животных, чтобы ответить на исследовательский вопрос — определенная мышца идентифицируется на основе ее функции in vivo и распределения типов волокон. После этического одобрения и, при необходимости, государственного одобрения животное гуманно усыпляется. Гуманные методы различаются в зависимости от страны, наиболее подходящие основаны на этическом одобрении и уровне квалификации исследователя. Необходимо соблюдать ряд дополнительных критериев, чтобы гарантировать, что животное полностью мертво без возможности восстановления, что включает прекращение кровотока путем удаления сердца из кровеносной системы и/или полное разрушение мозга и позвоночника. После этого обычно быстро получают общие показатели морфологии животного, такие как длина животного, масса тела и другие биомеханические маркеры, которые могут иметь значение. Затем животное готовят к сбору целевой мышцы. В изолированных мышцах это, как правило, мышцы задних конечностей, такие как soleus или EDL млекопитающих, или plantaris или iliotibialis амфибий. Другие мышцы, которые были исследованы in vitro, включают диафрагму и папиллярную мышцу .

Для успешного выделения скелетных мышц требуются особые условия. Ткань следует изолировать в часто заменяемом охлажденном растворе Рингера или растворе Кребса-Хензелейта, чтобы замедлить метаболические условия, отсюда необходимость в охлажденной среде для препарирования, и чтобы предотвратить гибель ткани из-за отсутствия субстратов в среде, отсюда необходимость в частой смене растворов. Раствор для препарирования должен постоянно насыщаться кислородом с соответствующей концентрацией кислорода и углекислого газа для ткани, которая готовится. Обычно ткани немлекопитающих готовятся в газообразном растворе, продуваемом 98% кислорода, 2% углекислого газа, в то время как ткани млекопитающих — в растворе, продуваемом 95% кислорода, 5% углекислого газа. Требуется микроскоп с соответствующим уровнем увеличения из-за ловкости, необходимой для выделения мышц. Внешний волоконно-оптический источник света также полезен для обеспечения достаточного освещения без выделения тепла.

Не существует правильного подхода к подготовке мышц к тестированию, пока мышца не повреждена во время подготовки, мышечно-сухожильный блок не поврежден и есть что-то, что можно использовать для закрепления мышцы в испытательной установке. Кусочки кости можно оставить на проксимальном и/или дистальном конце скелетных мышц, чтобы обеспечить закрепление. Кроме того, можно использовать шелковые швы или алюминиевые Т-образные фольговые зажимы для обертывания сухожилия мышцы, чтобы обеспечить как поддержку сухожилия, так и использовать их для закрепления в механической установке.

Оборудование

Для in vitro мышечного тестирования обычно требуется двухрежимный серводвигатель, который может как контролировать, так и обнаруживать изменения силы и длины. Если двухрежимная система недоступна, можно использовать независимый датчик силы и рычаг двигателя. Один конец образца ткани закрепляется на месте с помощью иглы, если она зашита, или зажима типа «крокодил», если она подготовлена с помощью алюминиевых Т-образных зажимов, в то время как другой конец прикрепляется к серводвигателю. Вся мышца погружается в раствор Рингера или раствор Кребса-Хензелейта с пузырьками кислорода, чтобы сохранить ткань живой и метаболически активной. Раствор нагревается, как правило, с помощью внешней водяной бани с нагревателем/охладителем, до соответствующей температуры испытания для тестируемой мышцы. Мышцы стимулируются к сокращению путем подачи электрического тока либо на нерв, который иннервирует мышцу, либо через платиновые электроды, помещенные в циркулирующий раствор, чтобы вызвать реакцию всей мышцы. Серводвигатель обнаруживает изменения силы и/или длины из-за сокращения мышцы . Уровень стимуляции часто устанавливается на уровне, который обеспечивает максимальное вовлечение двигательных единиц . Сервомотор может быть запрограммирован на поддержание заданной силы, позволяя мышце изменять длину, и наоборот, или мышца может быть подвергнута более сложному тестированию, например, в рабочих циклах . При использовании перистых мышц часто используется сономикрометрия для точного определения длины волокна во время теста.

Шкала

Тестирование мышц in vitro может проводиться на любом масштабе мышечной организации — целых групп мышц (при условии, что они имеют общее место прикрепления или начало, как в четырехглавой мышце человека), отдельной мышцы, «пучка» мышечных волокон , отдельного мышечного волокна, отдельной миофибриллы, отдельного саркомера , кардиомиоцита или даже полусаркомера. Мышечные волокна могут быть неповрежденными или могут быть «очищены», процесс, который удаляет клеточную мембрану, саркоплазматический ретикулум и цитоплазму, обеспечивая больший доступ к сократительным компонентам саркомера.

Типичные тесты

Обычно проверяются несколько свойств, и в каждом эксперименте часто используется подмножество этих свойств, включая время сокращения, тетаническую силу, соотношение силы и длины, соотношение силы и скорости, рабочие циклы , испытания на усталость, частоту слияния и энергетические затраты.

На месте

Недавно был использован гибридный подход между in vitro и in vivo , называемый in situ , при котором организм подвергается терминальной анестезии, а тесты in vivo проводятся с мышцей, все еще прикрепленной к организму. Это гарантирует, что мышца будет поддерживаться при правильной температуре и будет достаточно снабжаться питательными веществами и кислородом через кровь, но процедура более сложная, и некоторые тесты могут оказаться невозможными. ^[2]

Разновидность

Тестирование мышц in vitro почти никогда не применяется у людей, за исключением небольших участков мышц, удаляемых с помощью биопсии или во время хирургического вмешательства по поводу других заболеваний. Тестирование, как правило, сложнее у млекопитающих и птиц из-за высоких температур и потребностей мышц в кислороде, что приводит к быстрой гибели клеток после удаления мышечной ткани из организма. Скелетные мышцы млекопитающих обычно тестируются при температуре ~25°C, чтобы продлить протокол тестирования как можно дольше. Температура тестирования ~37°C также может использоваться во время тестирования целых изолированных скелетных мышц млекопитающих, чтобы лучше воспроизвести температуру, обнаруженную in vivo . Кроме того, важно учитывать термическую специализацию скелетных мышц, при этом основные мышцы более восприимчивы к изменениям механической производительности при небольших изменениях температуры, чем периферические мышцы. ^[3] У эктотермных животных (рептилий, амфибий, рыб и беспозвоночных) мышечная ткань может выживать вне организма в течение нескольких часов или даже дней, в зависимости от температуры и организма. Многие эксперименты проводятся при температуре около 0°C, чтобы продлить срок службы мышцы. Кроме того, у рыб и земноводных можно отделить одно мышечное волокно, сохранив его нетронутым, но у других видов это обычно невозможно.

Преимущества изолированного мышечного тестирования

Изоляция мышечной ткани in vitro позволяет получать индивидуальные данные о функции мышечной клетки без присутствия сигнальных немышечных клеток поблизости. ^{[1] Тестирование} in vitro позволяет проводить точную стимуляцию мышцы, предоставляя точные данные о врожденном поведении ткани. ^[4] Тестирование изолированной мышцы ограничивает другие факторы в окружающей среде вокруг ткани, такие как субстраты. Тестирование изолированной мышцы in vitro является полезной процедурой, основанной на ее идеальной точности, правильности и воспроизводимости. ^[5]

Недостатки изолированного мышечного тестирования

Смотрите также

Ссылки

^ ab Blau HM, Webster C (сентябрь 1981 г.). «Выделение и характеристика мышечных клеток человека». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 78 (9): 5623– 5627. Bibcode :1981PNAS...78.5623B. doi : 10.1073/pnas.78.9.5623 . PMC 348807 . PMID 6946499.
^ aursc20dev (2012-11-08). "Преимущества тестирования мышечной механики in-situ или in-vivo". Aurora Scientific . Получено 2023-06-27 .{{cite web}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )
^ Джеймс RS, Таллис J, Ангиллетта MJ (январь 2015 г.). «Региональная тепловая специализация у млекопитающих: температура влияет на выходную мощность основных мышц больше, чем периферических мышц у взрослых мышей (Mus musculus)» (PDF) . Журнал сравнительной физиологии B: биохимическая, системная и экологическая физиология . 185 (1): 135– 142. doi :10.1007/s00360-014-0872-6. PMID 25403362. S2CID 17011933.
^ Смит Л.Р., Мейер Г.А. (2020). «Эксплантаты скелетных мышц: модели ex-vivo для изучения поведения клеток в сложной тканевой среде». Connective Tissue Research . 61 ( 3–4 ): 248–261 . doi :10.1080/03008207.2019.1662409. PMC 8837600. PMID 31492079 .
^ Dessauge F, Schleder C, Perruchot MH, Rouger K (май 2021 г.). "3D in vitro модели скелетных мышц: миопсфера, миобунда и биопечатная мышечная конструкция". Veterinary Research . 52 (1): 72. doi : 10.1186/s13567-021-00942-w . PMC 8136231 . PMID 34011392.

[:0-1] Blau HM, Webster C (сентябрь 1981 г.). «Выделение и характеристика мышечных клеток человека». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 78 (9): 5623– 5627. Bibcode :1981PNAS...78.5623B. doi : 10.1073/pnas.78.9.5623 . PMC 348807 . PMID 6946499.

[2] ursc20dev (2012-11-08). "Преимущества тестирования мышечной механики in-situ или in-vivo". Aurora Scientific . Получено 2023-06-27 .{{cite web}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )

[3] Джеймс RS, Таллис J, Ангиллетта MJ (январь 2015 г.). «Региональная тепловая специализация у млекопитающих: температура влияет на выходную мощность основных мышц больше, чем периферических мышц у взрослых мышей (Mus musculus)» (PDF) . Журнал сравнительной физиологии B: биохимическая, системная и экологическая физиология . 185 (1): 135– 142. doi :10.1007/s00360-014-0872-6. PMID 25403362. S2CID 17011933.

[4] Смит Л.Р., Мейер Г.А. (2020). «Эксплантаты скелетных мышц: модели ex-vivo для изучения поведения клеток в сложной тканевой среде». Connective Tissue Research . 61 ( 3–4 ): 248–261 . doi :10.1080/03008207.2019.1662409. PMC 8837600. PMID 31492079 .

[5] Dessauge F, Schleder C, Perruchot MH, Rouger K (май 2021 г.). "3D in vitro модели скелетных мышц: миопсфера, миобунда и биопечатная мышечная конструкция". Veterinary Research . 52 (1): 72. doi : 10.1186/s13567-021-00942-w . PMC 8136231 . PMID 34011392.