Иммунопероксидаза

Иммунопероксидаза — это тип иммуноокрашивания, используемый в молекулярной биологии , медицинских исследованиях и клинической диагностике. В частности, иммунопероксидазные реакции относятся к подклассу иммуногистохимических или иммуноцитохимических процедур, в которых антитела визуализируются посредством реакции, катализируемой пероксидазой.

Иммуногистохимия и иммуноцитохимия — это методы, используемые для определения того, в каких клетках или частях клеток находится определенный белок или другая макромолекула . ​​Эти красители используют антитела для связывания со специфическими антигенами , обычно белкового или гликопротеинового происхождения. Поскольку антитела обычно невидимы, для обнаружения этих связанных антител необходимо использовать специальные стратегии. В иммунопероксидазной процедуре фермент , известный как пероксидаза, используется для катализа химической реакции с целью получения окрашенного продукта.

Проще говоря, очень тонкий срез ткани фиксируется на стекле, инкубируется с антителом или серией антител, последнее из которых химически связано с пероксидазой. После проявления окраски путем добавления химического субстрата распределение окраски можно исследовать с помощью микроскопии .

Первоначально все антитела, полученные для иммуноокрашивания, были поликлональными , т.е. полученными в результате обычных реакций антител у животных, таких как лошади или кролики. Теперь многие из них являются моноклональными , т.е. получены в культуре тканей. Моноклональные антитела, состоящие только из одного типа антител, как правило, обеспечивают большую антигенную специфичность, а также, как правило, более последовательны между партиями.

Первым шагом в иммунопероксидазном окрашивании является связывание специфического (первичного) антитела с образцом клетки или ткани. Затем обнаружение первичного антитела может быть выполнено напрямую (пример 1) или косвенно (примеры 2 и 3).

Пример 1. Первичное антитело можно напрямую пометить ферментом пероксидазой , который затем используется для катализа химической реакции с образованием окрашенного продукта.

Пример 2. Первичное антитело может быть помечено небольшой молекулой, которая может быть распознана связывающей молекулой, конъюгированной с пероксидазой, с высокой аффинностью. Наиболее распространенным примером этого является связанное с биотином первичное антитело, которое связывается со связанным с ферментом стрептавидином . Этот метод может быть использован для усиления сигнала.

Пример 3. Немеченое первичное антитело обнаруживается с помощью общего вторичного антитела , которое распознает все антитела, происходящие от того же вида животных, что и первичное. Вторичное антитело мечено пероксидазой.

Оптимальное окрашивание зависит от ряда факторов, включая разбавление антител, окрашивающие химикаты, подготовку и/или фиксацию клеток/ткани и длительность инкубации с антителами/окрашивающими реагентами. Они часто определяются методом проб и ошибок, а не каким-либо систематическим подходом.

Другие каталитические ферменты, такие как щелочная фосфатаза, могут использоваться вместо пероксидаз как для прямых, так и для непрямых методов окрашивания. В качестве альтернативы первичное антитело может быть обнаружено с помощью флуоресцентной метки ( иммунофлуоресценции ) или прикреплено к коллоидным золотым частицам для электронной микроскопии .

Иммунопероксидазное окрашивание применяется в клинической диагностике и лабораторных исследованиях .

В клинической диагностике иммуноокрашивание может использоваться на биопсиях тканей для более детального гистопатологического исследования. В случае рака оно может помочь в субклассификации опухолей. Иммуноокрашивание также может использоваться для диагностики кожных заболеваний, гломерулонефрита и субклассификации амилоидных отложений. Схожие методы также полезны для субтипирования лимфоцитов , которые все выглядят довольно похожими при световой микроскопии.

В лабораторных исследованиях антитела против специфических маркеров клеточной дифференциации могут использоваться для маркировки отдельных типов клеток. Это может позволить лучше понять механистические изменения в конкретных клеточных линиях, возникающие в результате конкретного экспериментального вмешательства.

• Непрямой иммунопероксидазный анализ

• Протоколы иммуногистохимии, буферы и устранение неполадок