пятно Hoechst
Флуоресцентный краситель, используемый для окрашивания ДНК
Химическая структура красителей Hoechst

Красители Hoechst являются частью семейства синих флуоресцентных красителей, используемых для окрашивания ДНК . [1] [2] Эти бис-бензимиды были первоначально разработаны Hoechst AG , которая пронумеровала все свои соединения так, что краситель Hoechst 33342 является 33 342-м соединением, производимым компанией. Существует три родственных красителя Hoechst: Hoechst 33258, Hoechst 33342 и Hoechst 34580. Красители Hoechst 33258 и Hoechst 33342 являются наиболее часто используемыми, и они имеют схожие спектры возбуждения – испускания .

Молекулярные характеристики

Спектры возбуждения-испускания красителей Hoechst

Оба красителя возбуждаются ультрафиолетовым светом около 350  нм , и оба испускают сине-голубой флуоресцентный свет около максимума спектра испускания при 461 нм. Несвязанный краситель имеет максимальную флуоресцентную эмиссию в диапазоне 510–540 нм. Красители Hoechst можно возбуждать с помощью ксеноновой или ртутной дуговой лампы или ультрафиолетового лазера . Существует значительный сдвиг Стокса между спектрами возбуждения и испускания, что делает красители Hoechst полезными в экспериментах, в которых используются несколько флуорофоров . Интенсивность флуоресценции красителей Hoechst также увеличивается с ростом pH растворителя . [3]

Красители Hoechst растворимы в воде и органических растворителях, таких как диметилформамид или диметилсульфоксид . Концентрации могут достигать 10 мг/мл. Водные растворы стабильны при температуре 2–6 °C в течение как минимум шести месяцев при защите от света. Для длительного хранения растворы замораживают при температуре −20 °C или ниже. [3]

Hoechst 33258 (пурпурный) связан с малой бороздкой ДНК (зеленый и синий). Из PDB : 264D ​.

Красители связываются с малой бороздкой двухцепочечной ДНК, отдавая предпочтение последовательностям, богатым аденином и тимином . Хотя красители могут связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, двухцепочечные цепи ДНК, богатые АТ, значительно усиливают флуоресценцию. [4] Красители Hoechst проницаемы для клеток и могут связываться с ДНК в живых или фиксированных клетках . Таким образом, эти красители часто называют суправитальными , что означает, что живые клетки выживают при обработке этими соединениями. Клетки, которые экспрессируют специфические белки -транспортеры кассет, связывающих АТФ, также могут активно транспортировать эти красители из своей цитоплазмы . [ необходима цитата ]

Приложения

Просвечивающее изображение клеток HeLa с наложением окраски Hoechst 33258 (синий). Самая левая клетка находится в стадии прометафазы митоза ; ее хромосомы ярко флуоресцируют, поскольку содержат сильно уплотненную ДНК.
Флуоресцентное изображение культивируемых нейтрофилов, выделенных из венозной крови человека с болезнью Альцгеймера. Образец был обработан красителем Hoechst 33342, который используется для окрашивания ДНК. На снимке показано высвобождение ДНК нейтрофилом в виде туманной области в центре поля зрения, что указывает на спонтанную активацию образования нейтрофильных внеклеточных ловушек у пациентов с болезнью Альцгеймера, что обычно не наблюдается у здоровых партнеров.

Концентрация 0,1–12 мкг/мл обычно используется для окрашивания ДНК в бактериях или эукариотических клетках. Клетки окрашиваются в течение 1–30 мин при комнатной температуре или 37 °C, а затем промываются для удаления несвязанного красителя. Зеленая флуоресценция несвязанного красителя Hoechst может наблюдаться на образцах, которые окрашены слишком большим количеством красителя или которые промыты частично. [3] Красители Hoechst часто используются в качестве замены другого красителя нуклеиновых кислот, называемого DAPI .

Основные различия между красителями Hoechst и DAPI:

  • Красители Hoechst менее токсичны, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток. [5]
  • Дополнительная этильная группа в некоторых красителях Hoechst (Hoechst 33342) делает их более проницаемыми для клеток. [6]
  • Существуют красители для окрашивания ядер, которые позволяют определить жизнеспособность клеток после окрашивания. [ необходима ссылка ]

Hoechst 33342 и 33258 гасятся бромдезоксиуридином ( BrdU ), который обычно используется для обнаружения делящихся клеток. Hoechst 33342 демонстрирует в 10 раз большую проницаемость для клеток, чем H 33258. Клетки могут интегрировать BrdU в недавно синтезированную ДНК в качестве замены тимидина . Когда BrdU интегрируется в ДНК, предполагается, что бром деформирует малую бороздку, так что красители Hoechst не могут достичь своего оптимального места связывания. Связывание красителей Hoechst еще сильнее с ДНК, замещенной BrdU; однако флуоресценция не возникает. Красители Hoechst можно использовать с BrdU для мониторинга прогрессирования клеточного цикла . [7] [8]

Красители Hoechst обычно используются для окрашивания геномной ДНК в следующих случаях:

Hoechst efflux также используется для изучения кроветворных и эмбриональных стволовых клеток. Поскольку эти клетки способны эффективно выводить краситель, их можно обнаружить с помощью проточной цитометрии в так называемой боковой популяции . Это делается путем пропускания флуоресценции, испускаемой возбужденным hoechst, через красный и синий фильтры и построения графика hoechst red и blue друг против друга. [ необходима цитата ]

Токсичность и безопасность

Поскольку красители Hoechst связываются с ДНК, они мешают репликации ДНК во время деления клеток . Следовательно, они потенциально мутагенные и канцерогенные , поэтому следует соблюдать осторожность при обращении с ними и их утилизации. Краситель Hoechst используется для сортировки спермы у скота и людей. Его безопасность является предметом споров. [13] [14]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Latt, SA; Stetten, G; Juergens, LA; Willard, HF; Scher, CD (июль 1975 г.). «Последние разработки в области обнаружения синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты с помощью флуоресценции 33258 Hoechst». Журнал гистохимии и цитохимии . 23 (7): 493–505. doi : 10.1177/23.7.1095650 . PMID  1095650.
  2. ^ Latt, SA; Stetten, G (январь 1976). «Спектральные исследования 33258 Hoechst и родственных бисбензимидазольных красителей, полезных для флуоресцентного обнаружения синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты». Журнал гистохимии и цитохимии . 24 (1): 24–33. doi : 10.1177/24.1.943439 . PMID  943439.
  3. ^ abc "Hoechst Stains" (PDF) . Invitrogren (Molecular Probes). Архивировано из оригинала (PDF) 2009-04-19.
  4. ^ Португалия, J; Waring, MJ (28 февраля 1988 г.). «Назначение участков связывания ДНК для 4′,6-диамидин-2-фенилиндола и бисбензимида (Hoechst 33258). Сравнительное исследование футпринтинга». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Структура и экспрессия генов . 949 (2): 158–68. doi :10.1016/0167-4781(88)90079-6. PMID  2449244.
  5. ^ BD Bioscience (2009). Методы анализа иммунной функции (PDF) (2-е изд.). Becton, Dickinson and Company.
  6. ^ Буцявичюс, Йонас; Лукинавичюс, Гражвидас; Герасимайте, Рута (18 апреля 2018 г.). «Использование красителей Hoechst для окрашивания ДНК и не только». Хемосенсоры . 6 (2): 18. doi : 10.3390/chemosensors6020018 . hdl : 21.11116/0000-0001-A4FE-8 . ISSN  2227-9040.
  7. ^ Kubbies, M; Rabinovitch, PS (январь 1983). "Проточный цитометрический анализ факторов, которые влияют на эффект гашения BrdUrd-Hoechst в культивируемых человеческих фибробластах и ​​лимфоцитах". Цитометрия . 3 (4): 276–81. doi : 10.1002/cyto.990030408 . PMID  6185287.
  8. ^ Breusegem, SY; Clegg, RM; Loontiens, FG (1 февраля 2002 г.). «Специфичность последовательности оснований Hoechst 33258 и связывания DAPI с пятью сайтами ДНК (A/T)4 с кинетическими доказательствами более чем одного высокоаффинного комплекса Hoechst 33258-AATT». Журнал молекулярной биологии . 315 (5): 1049–61. doi :10.1006/jmbi.2001.5301. PMID  11827475.
  9. ^ Iain Johnson, Michelle TZ Spence, ред. (2011). Справочник по молекулярным зондам: руководство по флуоресцентным зондам и технологиям маркировки (11-е изд.). Invitrogen. ISBN 978-0-9829279-1-5.
  10. ^ Kubbies, M (1990). «Проточно-цитометрическое распознавание повреждения хроматина, вызванного кластогеном, в лимфоцитах G0/G1 с помощью нестехиометрического связывания флуорохрома Hoechst». Цитометрия . 11 (3): 386–94. doi : 10.1002/cyto.990110309 . PMID  1692786.
  11. ^ ab Mocharla, R; Mocharla, H; Hodes, ME (23 декабря 1987 г.). "Новый, чувствительный метод флуорометрического окрашивания для обнаружения ДНК в препаратах РНК". Nucleic Acids Research . 15 (24): 10589. doi :10.1093/nar/15.24.10589. PMC 339970. PMID  2447564 . 
  12. ^ Sterzel, W; Bedford, P; Eisenbrand, G (июнь 1985). «Автоматизированное определение ДНК с использованием флуорохрома Hoechst 33258». Аналитическая биохимия . 147 (2): 462–7. doi :10.1016/0003-2697(85)90299-4. PMID  2409841.
  13. ^ Эшвуд-Смит, М. Дж. (1994). «Безопасность отбора сперматозоидов человека методом проточной цитометрии». Репродукция человека . 9 (5). Oxford University Press : 757–759. doi : 10.1093/oxfordjournals.humrep.a138589. PMID  7929716.
  14. ^ Parrilla, I; Vázquez, JM; Cuello, C; Gil, MA; Roca, J; Di Berardino, D; Martínez, EA (2004). «Окрашивание Hoechst 33342 и воздействие ультрафиолетового лазера не вызывают генотоксических эффектов в сперматозоидах хряка, отсортированных по потоку». Reproduction . 128 (5): 615–621. doi : 10.1530/rep.1.00288 . PMID  15509707.
На Викискладе есть медиафайлы по теме Hoechst stains .
  • Спектральные следы флуоресцентных красителей
  • Руководство по применению морилок Hoechst
  • Онлайн-руководство по флуоресцентным зондам и технологиям коммерческой маркировки
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Hoechst_stain&oldid=1193827530"