HaloTag

Самомаркирующаяся белковая метка

HaloTag — это самомаркирующийся белковый тег. Это белок из 297 остатков (33 кДа), полученный из бактериального фермента , предназначенный для ковалентного связывания с синтетическим лигандом. Бактериальный фермент может быть слит с различными интересующими белками. ^[1] Синтетический лиганд выбирается из ряда доступных лигандов в соответствии с типом проводимых экспериментов. Этот бактериальный фермент представляет собой галоалкандегалогеназу , которая действует как гидролаза и предназначена для облегчения визуализации субклеточной локализации интересующего белка, иммобилизации интересующего белка или захвата партнеров по связыванию интересующего белка в его биохимической среде. ^[2] HaloTag состоит из двух ковалентно связанных сегментов, включая галоалкандегалогеназу и синтетический лиганд по выбору. Эти синтетические лиганды состоят из реактивного хлоралканового линкера, связанного с функциональной группой. ^[3] Функциональные группы могут быть либо биотиновыми (могут использоваться как метка сродства), либо могут быть выбраны из пяти доступных флуоресцентных красителей, включая кумарин, орегонский зеленый, Alexa Fluor 488, diAcFAM и TMR. Эти флуоресцентные красители могут использоваться для визуализации как живых, так и химически фиксированных клеток. ^[4]

Механизм

HaloTag — это гидролаза, имеющая генетически модифицированный активный центр, который специфически связывает реактивный хлоралкановый линкер и имеет повышенную скорость связывания лиганда. ^[5] Реакция, которая образует связь между белковой меткой и хлоралкановым линкером, является быстрой и по существу необратимой в физиологических условиях из-за терминального хлора в линкерной части. ^[6] В вышеупомянутой реакции нуклеофильная атака хлоралканового реактивного линкера вызывает замещение галогена аминокислотным остатком, что приводит к образованию ковалентного алкилферментного промежуточного продукта. Затем этот промежуточный продукт будет гидролизован аминокислотным остатком в гидролазе дикого типа. ^[7] Это приведет к регенерации фермента после реакции. Однако в модифицированной галогеналкановой дегалогеназе (HaloTag) промежуточный продукт реакции не может пройти через последующую реакцию, поскольку он не может быть гидролизован из-за мутации в ферменте. Это приводит к тому, что промежуточное соединение сохраняется в виде стабильного ковалентного аддукта, с которым не происходит никакой связанной обратной реакции. ^[8]

Использует

Слитые белки HaloTagged могут быть экспрессированы с использованием стандартных методов экспрессии рекомбинантных белков . ^[9] Кроме того, существует несколько коммерческих векторов , которые требуют только вставки интересующего гена. ^[10] Поскольку бактериальные дегалогеназы относительно малы, а описанные выше реакции чужды клеткам млекопитающих, эндогенные метаболические реакции млекопитающих не оказывают никакого влияния. ^[11] После экспрессии слитого белка появляется широкий спектр потенциальных областей экспериментирования, включая ферментативные анализы, клеточную визуализацию, белковые массивы, определение субклеточной локализации и множество дополнительных возможностей. ^[12]

Недавно HaloTag был разработан для создания гибридных белковых и низкомолекулярных биосенсоров нейронной активности. ^[13] Эти сенсоры претерпевают конформационные изменения в ответ на скачки концентрации кальция во время нейронной активности; это конформационное изменение модулирует конформацию молекулы красителя, связанной с HaloTag. ^[13]

Смотрите также

Ссылки

^ Los GV, Encell LP, McDougall MG, Hartzell DD, Karassina N, Zimprich C и др. (июнь 2008 г.). «HaloTag: новая технология маркировки белков для визуализации клеток и анализа белков». ACS Chemical Biology . 3 (6): 373–82 . doi :10.1021/cb800025k. PMID 18533659.
^ Giepmans BN, Adams SR, Ellisman MH, Tsien RY (апрель 2006 г.). «Флуоресцентный набор инструментов для оценки расположения и функции белка». Science . 312 (5771): 217– 24. Bibcode :2006Sci...312..217G. doi :10.1126/science.1124618. PMID 16614209. S2CID 1288600.
^ Kogure T, Karasawa S, Araki T, Saito K, Kinjo M, Miyawaki A (май 2006 г.). «Флуоресцентный вариант белка из каменистого коралла Montipora способствует двухцветной однолазерной флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии». Nature Biotechnology . 24 (5): 577– 81. doi :10.1038/nbt1207. PMID 16648840. S2CID 19616823.
^ Miller LW, Cornish VW (февраль 2005 г.). «Избирательная химическая маркировка белков в живых клетках». Current Opinion in Chemical Biology . 9 (1): 56– 61. doi :10.1016/j.cbpa.2004.12.007. PMID 15701454.
^ Pries F, Kingma J, Krooshof GH, Jeronimus-Stratingh CM, Bruins AP, Janssen DB (май 1995). «Гистидин 289 необходим для гидролиза промежуточного алкилфермента галоалкандегалогеназы». Журнал биологической химии . 270 (18): 10405– 11. doi : 10.1074/jbc.270.18.10405 . PMID 7737973.
^ Waugh DS (июнь 2005 г.). «Максимальное использование тегов сродства». Тенденции в биотехнологии . 23 (6): 316– 20. doi :10.1016/j.tibtech.2005.03.012. PMID 15922084.
^ Chen I, Ting AY (февраль 2005 г.). «Сайт-специфическая маркировка белков малыми молекулами в живых клетках». Current Opinion in Biotechnology . 16 (1): 35– 40. doi :10.1016/j.copbio.2004.12.003. PMID 15722013.
^ Marks KM, Nolan GP (август 2006 г.). «Стратегии химической маркировки для биологии клетки». Nature Methods . 3 (8): 591– 6. doi :10.1038/nmeth906. PMID 16862131. S2CID 27848267.
^ Адамс SR, Кэмпбелл RE, Гросс LA, Мартин BR, Уолкап GK, Яо Y и др. (май 2002 г.). «Новые биарсенические лиганды и мотивы тетрацистеина для маркировки белков in vitro и in vivo: синтез и биологические приложения». Журнал Американского химического общества . 124 (21): 6063–76 . doi :10.1021/ja017687n. PMID 12022841.
^ "Векторы HaloTag в Promega" . Получено 9 февраля 2017 г.
^ Naested H, Fennema M, Hao L, Andersen M, Janssen DB, Mundy J (июнь 1999 г.). «Бактериальный ген дегалогеназы галоалкана как отрицательный селективный маркер в Arabidopsis» (PDF) . The Plant Journal . 18 (5): 571– 6. doi :10.1046/j.1365-313x.1999.00477.x. hdl : 11370/3359ce65-5249-4057-bd7d-b22451ea5e85 . PMID 10417708.
^ Janssen DB (апрель 2004 г.). «Эволюционирующие дегалогеназы галогеналканов». Current Opinion in Chemical Biology . 8 (2): 150– 9. doi :10.1016/j.cbpa.2004.02.012. PMID 15062775.
^ аб Део, Клэр; Абдельфаттах, Ахмед С.; Бхаргава, Херш К.; Берро, Адам Дж.; Фалько, Натали; Фаррантс, Хелен; Мойерт, Бенджамин; Чупанова, Мариам; Лавис, Люк Д.; Шрайтер, Эрик Р. (июнь 2021 г.). «HaloTag как общий каркас для настраиваемых хемигенетических индикаторов в дальнем красном диапазоне». Химическая биология природы . 17 (6): 718–723 . doi : 10.1038/s41589-021-00775-w. ISSN 1552-4469. PMID 33795886. S2CID 232763093.

[pmid18533659-1] Los GV, Encell LP, McDougall MG, Hartzell DD, Karassina N, Zimprich C и др. (июнь 2008 г.). «HaloTag: новая технология маркировки белков для визуализации клеток и анализа белков». ACS Chemical Biology . 3 (6): 373–82 . doi :10.1021/cb800025k. PMID 18533659.

[pmid16614209-2] Giepmans BN, Adams SR, Ellisman MH, Tsien RY (апрель 2006 г.). «Флуоресцентный набор инструментов для оценки расположения и функции белка». Science . 312 (5771): 217– 24. Bibcode :2006Sci...312..217G. doi :10.1126/science.1124618. PMID 16614209. S2CID 1288600.

[pmid16648840-3] Kogure T, Karasawa S, Araki T, Saito K, Kinjo M, Miyawaki A (май 2006 г.). «Флуоресцентный вариант белка из каменистого коралла Montipora способствует двухцветной однолазерной флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии». Nature Biotechnology . 24 (5): 577– 81. doi :10.1038/nbt1207. PMID 16648840. S2CID 19616823.

[pmid15701454-4] Miller LW, Cornish VW (февраль 2005 г.). «Избирательная химическая маркировка белков в живых клетках». Current Opinion in Chemical Biology . 9 (1): 56– 61. doi :10.1016/j.cbpa.2004.12.007. PMID 15701454.

[pmid7737973-5] Pries F, Kingma J, Krooshof GH, Jeronimus-Stratingh CM, Bruins AP, Janssen DB (май 1995). «Гистидин 289 необходим для гидролиза промежуточного алкилфермента галоалкандегалогеназы». Журнал биологической химии . 270 (18): 10405– 11. doi : 10.1074/jbc.270.18.10405 . PMID 7737973.

[pmid15922084-6] Waugh DS (июнь 2005 г.). «Максимальное использование тегов сродства». Тенденции в биотехнологии . 23 (6): 316– 20. doi :10.1016/j.tibtech.2005.03.012. PMID 15922084.

[pmid15722013-7] Chen I, Ting AY (февраль 2005 г.). «Сайт-специфическая маркировка белков малыми молекулами в живых клетках». Current Opinion in Biotechnology . 16 (1): 35– 40. doi :10.1016/j.copbio.2004.12.003. PMID 15722013.

[pmid16862131-8] Marks KM, Nolan GP (август 2006 г.). «Стратегии химической маркировки для биологии клетки». Nature Methods . 3 (8): 591– 6. doi :10.1038/nmeth906. PMID 16862131. S2CID 27848267.

[pmid12022841-9] Адамс SR, Кэмпбелл RE, Гросс LA, Мартин BR, Уолкап GK, Яо Y и др. (май 2002 г.). «Новые биарсенические лиганды и мотивы тетрацистеина для маркировки белков in vitro и in vivo: синтез и биологические приложения». Журнал Американского химического общества . 124 (21): 6063–76 . doi :10.1021/ja017687n. PMID 12022841.

[HaloTag_vectors_at_[[Promega]]-10] "Векторы HaloTag в Promega" . Получено 9 февраля 2017 г.

[pmid10417708-11] Naested H, Fennema M, Hao L, Andersen M, Janssen DB, Mundy J (июнь 1999 г.). «Бактериальный ген дегалогеназы галоалкана как отрицательный селективный маркер в Arabidopsis» (PDF) . The Plant Journal . 18 (5): 571– 6. doi :10.1046/j.1365-313x.1999.00477.x. hdl : 11370/3359ce65-5249-4057-bd7d-b22451ea5e85 . PMID 10417708.

[pmid15062775-12] Janssen DB (апрель 2004 г.). «Эволюционирующие дегалогеназы галогеналканов». Current Opinion in Chemical Biology . 8 (2): 150– 9. doi :10.1016/j.cbpa.2004.02.012. PMID 15062775.

[:0-13] аб Део, Клэр; Абдельфаттах, Ахмед С.; Бхаргава, Херш К.; Берро, Адам Дж.; Фалько, Натали; Фаррантс, Хелен; Мойерт, Бенджамин; Чупанова, Мариам; Лавис, Люк Д.; Шрайтер, Эрик Р. (июнь 2021 г.). «HaloTag как общий каркас для настраиваемых хемигенетических индикаторов в дальнем красном диапазоне». Химическая биология природы . 17 (6): 718–723 . doi : 10.1038/s41589-021-00775-w. ISSN 1552-4469. PMID 33795886. S2CID 232763093.