Зонд гибридизации
Фрагмент РНК или ДНК, который можно химически пометить

В молекулярной биологии гибридизационный зонд ( ГЗ ) представляет собой фрагмент ДНК или РНК , обычно длиной 15–10000 нуклеотидов , который может быть радиоактивно или флуоресцентно помечен . ГЗ можно использовать для обнаружения наличия нуклеотидных последовательностей в анализируемой РНК или ДНК, которые комплементарны последовательности в зонде. [1] Меченый зонд сначала денатурируют (нагреванием или в щелочных условиях, таких как воздействие гидроксида натрия ) в одноцепочечную ДНК (оцДНК), а затем гибридизуют с целевой оцДНК ( блоттинг по Саузерну ) или РНК ( блоттинг по Северному ), иммобилизованной на мембране или in situ .

Для обнаружения гибридизации зонда с его целевой последовательностью зонд помечается (или «маркируется») молекулярным маркером либо радиоактивных, либо (в последнее время) флуоресцентных молекул. Обычно используются маркеры 32P ( радиоактивный изотоп фосфора , включенный в фосфодиэфирную связь в ДНК зонда), дигоксигенин , нерадиоактивный маркер на основе антител , биотин или флуоресцеин. Затем обнаруживаются последовательности ДНК или транскрипты РНК , которые имеют умеренное или высокое сходство последовательности с зондом, путем визуализации гибридизированного зонда с помощью авторадиографии или других методов визуализации. Обычно либо делаются рентгеновские снимки фильтра, либо фильтр помещают под УФ-свет. Обнаружение последовательностей с умеренным или высоким сходством зависит от того, насколько строгие условия гибридизации были применены: высокие условия, такие как высокая температура гибридизации и низкое содержание соли в гибридизационных буферах, допускают гибридизацию только между последовательностями нуклеиновых кислот , которые очень похожи, тогда как низкие условия, такие как более низкая температура и высокое содержание соли, допускают гибридизацию, когда последовательности менее похожи.

Гибридизационные зонды, используемые в ДНК-микрочипах, относятся к ДНК, ковалентно прикрепленной к инертной поверхности, такой как покрытые стеклянные предметные стекла или генные чипы , с которой гибридизуется подвижная целевая ДНК . В зависимости от метода зонд может быть синтезирован с использованием фосфорамидитного метода или может быть создан и помечен с помощью ПЦР- амплификации или клонирования (оба являются более старыми методами). Для повышения стабильности зонда in vivo РНК не используется. Вместо этого могут использоваться аналоги РНК , в частности, морфолино -производные. Молекулярные ДНК- или РНК-зонды обычно используются при скрининге генных библиотек, обнаружении нуклеотидных последовательностей с помощью методов блоттинга и в других генных технологиях, таких как микрочипы нуклеиновых кислот и тканей .

Примеры зондов

Использование в микробной экологии

В области микробной экологии олигонуклеотидные зонды используются для определения присутствия микробных видов, родов или микроорганизмов, классифицированных на более широком уровне, таких как бактерии , археи и эукариоты , с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). [2] Зонды рРНК позволили ученым визуализировать микроорганизмы, которые еще предстоит культивировать в лабораторных условиях, путем извлечения последовательностей рРНК непосредственно из окружающей среды. [3] Примерами таких типов микроорганизмов являются:

  • Nevskia ramosa : N. ramosa — нейстонная бактерия, которая образует типичные дихотомически ветвящиеся розетки на поверхности мелководных пресноводных местообитаний. [4]
  • Achromatium oxaliferum : эта огромная бактерия (длина клетки до >100 мкм, диаметр до 50 мкм) содержит серные глобулы и массивные включения кальцита и обитает в верхних слоях пресноводных отложений. Она видна невооруженным глазом и своей устойчивостью к культивированию озадачила поколения микробиологов. [5]

Ограничения

В некоторых случаях дифференциация между видами может быть проблематичной при использовании последовательностей рРНК 16S из-за сходства. В таких случаях 23S рРНК может быть лучшей альтернативой. [6] Глобальная стандартная библиотека последовательностей рРНК постоянно становится больше и постоянно обновляется, и, таким образом, возможность случайного события гибридизации между специально разработанным зондом (на основе полных и текущих данных из ряда тестовых организмов) и нежелательным/неизвестным целевым организмом не может быть легко исключена. [7] Напротив, вполне вероятно, что существуют микроорганизмы, которые еще не идентифицированы, которые являются филогенетически членами целевой группы зонда, но имеют частичные или почти идеальные целевые сайты, обычно применяется при разработке группоспецифичных зондов.

Вероятно, наибольшим практическим ограничением этой техники является отсутствие доступной автоматизации. [8]

Использование в судебной экспертизе

В судебной экспертизе гибридизационные зонды используются, например, для обнаружения участков коротких тандемных повторов ( микросателлитов ) [9] и в методах полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ( ПДРФ ), которые широко используются как часть анализа профилирования ДНК .

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ "Гибридизация нуклеиновых кислот". www.ndsu.edu . Получено 2017-05-26 .
  2. ^ Аманн Р., Людвиг В. (2000). «Рибосомальные РНК-целевые нуклеиновые кислотные зонды для исследований в области микробной экологии». FEMS Microbiology Reviews . 24 (5): 555–565 . doi : 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00557.x . PMID  11077149.
  3. ^ Аманн, Р.; Людвиг, В.; Шлейфер, К.-Х. (1995). «Филогенетическая идентификация и обнаружение in situ отдельных микробных клеток без культивирования». Microbiological Reviews . 59 (1): 143–169 . doi : 10.1128/MMBR.59.1.143-169.1995 . PMC 239358 . PMID  7535888. 
  4. ^ Glöckner, FO; Babenzien HD; Amann R. (1998). "Филогения и идентификация in situ Nevskia ramosa". Appl. Environ. Microbiol . 64 (5): 1895–1901 . Bibcode :1998ApEnM..64.1895G. doi : 10.1128/AEM.64.5.1895-1901.1998 . PMC 106248 . PMID  9572969. 
  5. ^ Glöckner, FO; Babenzien HD; Amann R. (1999). "Филогения и разнообразие Achromatium oxaliferum ". Syst. Appl. Microbiol . 22 (1): 28– 38. doi :10.1016/s0723-2020(99)80025-3. PMID  10188276.
  6. ^ Fox, GE; Wisotzkey, JD; Jurtshuk Jr., P. (1992). «Насколько близко близко: идентичность последовательности 16S рРНК может быть недостаточной для гарантии идентичности видов». Int. J. Syst. Bacteriol . 42 (1): 166– 170. doi : 10.1099/00207713-42-1-166 . PMID  1371061.
  7. ^ Olsen, GJ; Lane, DJ; Giovannoni, SJ; Pace, NR; Stahl, DA (1986). «Микробная экология и эволюция: подход рибосомальной РНК». Annu. Rev. Microbiol . 40 : 337–365 . doi :10.1146/annurev.mi.40.100186.002005. PMID  2430518.
  8. ^ Аманн Р., Людвиг В. (2000). «Рибосомальные РНК-целевые нуклеиновые кислотные зонды для исследований в области микробной экологии». FEMS Microbiology Reviews . 24 (5): 555–565 . doi : 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00557.x . PMID  11077149.
  9. ^ Tytgat, Olivier (2021). "STRide зонды: зонды идентификации коротких тандемных повторов с одной меткой" (PDF) . Биосенсоры и биоэлектроника . 180 : 113135. doi : 10.1016/j.bios.2021.113135 . PMID  33690100.
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Hybridization_probe&oldid=1267391994"