Технология шлюза

Метод клонирования Gateway — это метод молекулярного клонирования , изобретенный и коммерциализируемый компанией Invitrogen с конца 1990-х годов, который использует реакции интеграции и вырезания рекомбинации, происходящие при заражении бактерий бактериофагом лямбда . Эта технология обеспечивает быстрый и высокоэффективный способ транспортировки последовательностей ДНК в многовекторные системы для функционального анализа и экспрессии белков с использованием att-сайтов Gateway и двух фирменных смесей ферментов, называемых BP Clonase и LR Clonase. In vivo эти реакции рекомбинации облегчаются рекомбинацией сайтов прикрепления из хромосомы лямбда/фага (attP) и бактерий (attB). В результате рекомбинации между сайтами attP и attB фаг интегрируется в бактериальный геном, окруженный двумя новыми сайтами рекомбинации (attLeft и attRight). Удаление фага из бактериальной хромосомы и регенерация сайтов attP и attB могут быть результатом рекомбинации сайтов attL и attR при определенных обстоятельствах.

Интересующие последовательности ДНК добавляются к модифицированным версиям этих специальных сайтов Gateway Att. Происходят две ферментные реакции: BP Clonase и LR Clonase. BP Clonase происходит между сайтами attB, окружающими вставку, и сайтами attP донорского вектора. Эта реакция катализируется смесью ферментов BP Clonase и производит клон входа, содержащий интересующую ДНК, фланкированную доменами attL. В качестве побочного продукта реакции летальный ген ccdB вырезается из донорского вектора. LR Clonase происходит между областями attL сгенерированного клона входа и областями attR целевого вектора и катализируется смесью ферментов LR Clonase. В результате получается клон экспрессии с интересующей ДНК, фланкированной областями attB. Как и в реакции BP, последовательность ДНК, содержащая ген ccdB, вырезается из целевого вектора.

Большие архивы клонов Gateway Entry, содержащие подавляющее большинство человеческих, мышиных и крысиных ORF ( открытых рамок считывания ), были клонированы из библиотек человеческой ДНК или химически синтезированы для поддержки исследовательского сообщества с использованием финансирования NIH (Национальных институтов здравоохранения) (например, Mammalian Gene Collection, http://mgc.nci.nih.gov/ Архивировано 25.02.2015 в Wayback Machine ). Наличие этих генных кассет в стандартной плазмиде клонирования Gateway помогает исследователям быстро переносить эти кассеты в плазмиды, которые облегчают анализ функции генов. Клонирование Gateway требует больше времени для первоначальной настройки и является более дорогим, чем традиционные методы клонирования на основе ферментов рестрикции и лигазы, но оно экономит время и предлагает более простое и высокоэффективное клонирование для последующих приложений.

Эта технология широко применяется в сообществе исследователей в области естественных наук, особенно для приложений, требующих переноса тысяч фрагментов ДНК в один тип плазмиды (например, содержащую промотор CMV для экспрессии белка в клетках млекопитающих) или для переноса одного фрагмента ДНК во множество различных типов плазмид (например, для экспрессии белка у бактерий, насекомых и млекопитающих).

Первый шаг в клонировании Gateway — подготовка клона Gateway Entry. Существует несколько различных способов создания клона entry.

1. Последовательности Gateway attB1 и attB2 добавляются к 5' и 3' концу фрагмента гена соответственно с использованием геноспецифичных праймеров ПЦР и ПЦР-амплификации. Затем продукты ПЦР-амплификации смешиваются с фирменной смесью плазмид, называемых Gateway "Donor vectors" (терминология Invitrogen), и фирменными ферментами "BP Clonase". Смесь ферментов катализирует рекомбинацию и вставку продукта ПЦР, содержащего последовательность attB, в сайты рекомбинации attP в векторе Gateway Donor. Когда кассета является частью целевой плазмиды, она называется "Entry clone" в номенклатуре Gateway, а рекомбинационные последовательности называются Gateway типа "attL".
2. Короткий конец, содержащий attL, добавляется с помощью метода TOPO — технологии, при которой фрагменты ДНК клонируются в определенные векторы без необходимости использования ДНК-лигаз.
3. Желаемую последовательность ДНК можно клонировать в сайт мультиклонирования, содержащий attL, с использованием фермента рестрикции.

Вторым шагом в клонировании Gateway является подготовка вектора назначения Gateway. Важно выбрать целевой вектор, который лучше всего подходит для вашей цели при подготовке клона экспрессии. Затем генную кассету в клоне Gateway Entry можно просто и эффективно перенести в любой вектор назначения Gateway (номенклатура Invitrogen для любой плазмиды Gateway, содержащей последовательности рекомбинации Gateway «attR» и такие элементы, как промоторы и эпитопные метки, но не ORF ) с помощью фирменной смеси ферментов «LR Clonase». Были созданы тысячи плазмид назначения Gateway, которые свободно распространяются среди исследователей по всему миру. Векторы назначения Gateway похожи на классические векторы экспрессии, содержащие несколько сайтов клонирования, перед вставкой интересующего гена с использованием расщепления рестриктазой и лигирования. Векторы назначения Gateway коммерчески доступны от Invitrogen, EMD ( Novagen ) и Covalys.

Третий шаг в клонировании Gateway — подготовка экспрессии интересующего вас гена. Обязательно используйте секвенирование или рестрикционный дайджест для проверки целостности вашего экспрессионного клона. Как только ваша конструкция заработает, вы можете трансформировать или трансфицировать клетки, которые вы собираетесь использовать в своих исследованиях.

Поскольку клонирование Gateway использует запатентованные рекомбинационные последовательности и фирменные смеси ферментов, доступные только от Invitrogen, технология не позволяет исследователям менять поставщиков и способствует эффекту привязки всех подобных запатентованных процедур.

Подведем итог различным этапам клонирования Gateway:

• Реакция Gateway BP: ПЦР-продукт с фланкирующими сайтами attB (на этом этапе также могут использоваться другие методы выделения ДНК, такие как рестрикционное расщепление) + донорский вектор, содержащий сайты attP + клоназа BP => клон Gateway Entry, содержащий сайты attL, фланкирующие интересующий ген
• Реакция шлюза LR: входной клон, содержащий сайты attL + целевой вектор, содержащий сайты attR, промоторы и теги + клоназа LR => экспрессирующий клон, содержащий сайты attB, фланкирующий интересующий ген, готовый к экспрессии гена.

• Гибкость : интересующую вас последовательность ДНК можно перенести в любую систему экспрессии всего за один шаг рекомбинации, когда вы создаете с ее помощью входной клон.
• Скорость : вместо того, чтобы тратить два или более дней на традиционное клонирование с рестрикцией и лигированием, подход Gateway позволяет создать конструкцию экспрессии всего за один день. Продукты attB-PCR также можно немедленно клонировать в целевые векторы, выполняя реакции BP и LR в одной и той же пробирке. В процессе клонирования не требуется никаких процедур рестрикции, лигирования или очистки геля.
• Клонирование множественных фрагментов : Клонирование Gateway может использоваться для одновременной вставки нескольких фрагментов ДНК в многочисленные векторы в одной пробирке. Для создания необходимого экспрессионного клона до четырех сегментов ДНК могут быть клонированы в один вектор Gateway в точном порядке и ориентации в одной пробирке. Конструкция векторов Gateway делает это возможным.
• Высокая эффективность : метод Gateway Cloning использует положительные и отрицательные маркеры селекции для повышения шансов успешного клонирования гена. Это означает, что процесс более эффективен, а значит, более вероятно, что он даст успешные результаты.
• Универсальность : Все типы фрагментов ДНК могут быть клонированы с использованием методов ПЦР. Клонирование доступно для многих различных видов организмов, от млекопитающих до бактерий.

• Клонирование
• Кассета шлюза
• Субклонирование