Анализ GLAD-ПЦР

Анализ G lal-гидролиза и лигирования с помощью ПЦР, зависимой от адаптера ( анализ GLAD -ПЦР ^[1] ), является новым методом определения сайтов R(5mC)GY, образующихся в ходе метилирования ДНК de novo с помощью ДНК-метилтрансфераз DNMT3A и DNMT3B . Анализ GLAD-ПЦР не требует обработки ДНК бисульфитом.

Метод был специально разработан для определения метилирования интересующего сайта RCGY в геномах человека и млекопитающих в избытке по сравнению с соответствующими неметилированными сайтами. Это типичная ситуация для препаратов ДНК из клинических образцов крови и тканей.

Анализ GLAD-PCR основан на новом типе ферментов - сайт-специфических метил-направленных ДНК-эндонуклеазах (MD DNA эндонуклеазы). Эти ферменты по биохимическим свойствам очень похожи на рестриктазы и полностью расщепляют ДНК, но действуют противоположным образом: они расщепляют только метилированную ДНК и совсем не расщепляют неметилированную ДНК.

ДНК-метилтрансферазы млекопитающих DNMT1, DNMT3a и DNMT3b катализируют реакцию метилирования ДНК.

DNMT1 поддерживает паттерн метилирования ДНК in vivo, модифицируя новую цепь после репликации.
DNMT3a и DNMT3b отвечают за метилирование ДНК de novo, включая аномальное гиперметилирование в раковых клетках.

Хорошо известно, что гиперметилирование CpG -островков в регуляторных областях промотора и/или первого экзона в различных генах часто происходит на ранних стадиях спорадического канцерогенеза . Это приводит к снижению экспрессии генов в опухолевых клетках, тогда как в здоровой ткани соответствующие гены остаются активными. ^[2] Таким образом, обнаружение таких эпигенетических биомаркеров является одним из наиболее перспективных диагностических и прогностических инструментов ^[3]

Изучение субстратной специфичности DNMT3a и DNMT3b показало, что оба фермента преимущественно распознают сайт RCGY и модифицируют внутренний CG-динуклеотид с образованием последовательности 5'-R(5mC)GY-3'/3'-YG(5mC) R-5'. ^[4] Один из новых ферментов GlaI распознает и расщепляет сайт R(5mC)GY. ^[5] Благодаря этой уникальной субстратной специфичности GlaI является удобным инструментом для идентификации de novo метилированных сайтов в ДНК человека и млекопитающих.

DNMT3 и GLAI имеют одинаковую специфичность

Анализ GLAD-ПЦР включает в себя 3 простых этапа:

Гидролиз GlaI исследуемой ДНК. На этом этапе гидролизуются только сайты R(5mC)GY. Неметилированные сайты RCGY остаются неразрезанными.
Универсальное адаптерное лигирование. В качестве адаптера используется олигонуклеотидный дуплекс 5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-pGGACGAGAAAGTAGCp-5', где «p» означает фосфат.
Последующая ПЦР в реальном времени с зондом Taqman. Геномный праймер и зонд TaqMan предназначены для интересующего участка ДНК, другой гибридный праймер состоит из двух частей: одна часть комплементарна универсальному адаптеру, а другая - ДНК в точке гидролиза GlaI.
Анализ GLAD-ПЦР

Анализ проводится в одной пробирке, занимает около 2–3 часов и определяет даже несколько копий ДНК с интересующим участком R(5mC)GY.

Ссылки

^ Способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданной позиции непрерывной ДНК Архивировано 2017-03-16 в Wayback Machine // Патент RU 2525710
^ Касерес, И. Ибаньес де; Кэрнс, П. (2007-07-01). «Метилированные последовательности ДНК для раннего выявления рака, молекулярной классификации и прогнозирования ответа на химиотерапию». Клиническая и трансляционная онкология . 9 (7): 429– 437. doi :10.1007/s12094-007-0081-9. ISSN 1699-048X. PMID 17652056. S2CID 10757992.
^ Gyparaki, Melina-Theoni; Basdra, Efthimia K.; Papavassiliou, Athanasios G. (2013-11-01). «Биомаркеры метилирования ДНК как диагностические и прогностические инструменты при колоректальном раке». Журнал молекулярной медицины . 91 (11): 1249– 1256. doi :10.1007/s00109-013-1088-z. ISSN 0946-2716. PMID 24057814. S2CID 15698970.
^ Ханда, Викас; Йельч, Альберт (2005-05-20). «Глубокое предпочтение фланкирующей последовательности метилтрансфераз млекопитающих Dnmt3a и Dnmt3b формирует человеческий эпигеном». Журнал молекулярной биологии . 348 (5): 1103– 1112. doi :10.1016/j.jmb.2005.02.044. PMID 15854647.
^ Тарасова, Галина В.; Наякшина, Татьяна Н.; Дегтярев, Сергей КХ (2008-01-01). "Субстратная специфичность новой метил-направленной ДНК-эндонуклеазы GlaI". BMC Molecular Biology . 9 : 7. doi : 10.1186/1471-2199-9-7 . ISSN 1471-2199. PMC 2257971 . PMID 18194583.

[1] Способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданной позиции непрерывной ДНК Архивировано 2017-03-16 в Wayback Machine // Патент RU 2525710

[2] Касерес, И. Ибаньес де; Кэрнс, П. (2007-07-01). «Метилированные последовательности ДНК для раннего выявления рака, молекулярной классификации и прогнозирования ответа на химиотерапию». Клиническая и трансляционная онкология . 9 (7): 429– 437. doi :10.1007/s12094-007-0081-9. ISSN 1699-048X. PMID 17652056. S2CID 10757992.

[3] Gyparaki, Melina-Theoni; Basdra, Efthimia K.; Papavassiliou, Athanasios G. (2013-11-01). «Биомаркеры метилирования ДНК как диагностические и прогностические инструменты при колоректальном раке». Журнал молекулярной медицины . 91 (11): 1249– 1256. doi :10.1007/s00109-013-1088-z. ISSN 0946-2716. PMID 24057814. S2CID 15698970.

[4] Ханда, Викас; Йельч, Альберт (2005-05-20). «Глубокое предпочтение фланкирующей последовательности метилтрансфераз млекопитающих Dnmt3a и Dnmt3b формирует человеческий эпигеном». Журнал молекулярной биологии . 348 (5): 1103– 1112. doi :10.1016/j.jmb.2005.02.044. PMID 15854647.

[5] Тарасова, Галина В.; Наякшина, Татьяна Н.; Дегтярев, Сергей КХ (2008-01-01). "Субстратная специфичность новой метил-направленной ДНК-эндонуклеазы GlaI". BMC Molecular Biology . 9 : 7. doi : 10.1186/1471-2199-9-7 . ISSN 1471-2199. PMC 2257971 . PMID 18194583.