Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания

Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) — это метод определения кинетики диффузии через ткани или клетки. Он способен количественно оценить двумерную латеральную диффузию молекулярно тонкой пленки, содержащей флуоресцентно меченые зонды, или исследовать отдельные клетки. Этот метод очень полезен в биологических исследованиях диффузии клеточной мембраны и связывания белков. Кроме того, поверхностное осаждение флуоресцирующего фосфолипидного бислоя (или монослоя) позволяет характеризовать гидрофильные (или гидрофобные ) поверхности с точки зрения поверхностной структуры и свободной энергии.

Похожие, хотя и менее известные, методы были разработаны для исследования трехмерной диффузии и связывания молекул внутри клетки; их также называют FRAP.

Базовый аппарат состоит из оптического микроскопа , источника света и некоторого флуоресцентного зонда. Флуоресцентное излучение зависит от поглощения определенной оптической длины волны или цвета, что ограничивает выбор ламп. Чаще всего используется источник широкого спектра ртути или ксенона в сочетании с цветным фильтром. Метод начинается с сохранения фонового изображения образца перед фотообесцвечиванием. Затем источник света фокусируется на небольшом участке видимой области либо путем переключения на объектив микроскопа с большим увеличением, либо с помощью лазерного света соответствующей длины волны. Флуорофоры в этой области получают высокоинтенсивное освещение, которое приводит к быстрому истечению их времени жизни флуоресценции (ограничено примерно 105 ^{фотонов} до затухания). Теперь изображение в микроскопе представляет собой однородно флуоресцентное поле с заметным темным пятном. По мере продолжения броуновского движения все еще флуоресцирующие зонды будут диффундировать по всему образцу и заменять нефлуоресцентные зонды в обесцвеченной области. Эта диффузия происходит упорядоченным образом, аналитически определяемым из уравнения диффузии . Предполагая гауссов профиль для отбеливающего луча, константу диффузии D можно просто рассчитать по формуле:

${\displaystyle D={\frac {w^{2}}{4t_{D}}}}$

где w — радиус пучка, а t _D — «характерное» время диффузии. ^{[1] [2]}

Первоначально метод FRAP был предназначен для использования в качестве средства для характеристики подвижности отдельных липидных молекул внутри клеточной мембраны. ^[1] Несмотря на большую полезность в этой роли, современные исследования больше склоняются к изучению искусственных липидных мембран. Поддерживаемые гидрофильными или гидрофобными субстратами (для создания липидных бислоев или монослоев соответственно) и включающие мембранные белки , эти биомиметические структуры потенциально полезны в качестве аналитических устройств для определения идентичности неизвестных веществ, понимания клеточной трансдукции и идентификации участков связывания лигандов.

Этот метод обычно используется в сочетании с белками слияния зеленого флуоресцентного белка (GFP) , где изучаемый белок сливается с GFP. При возбуждении определенной длиной волны света белок будет флуоресцировать. ^[3] Когда изучаемый белок производится с GFP, тогда флуоресценцию можно отслеживать. Фоторазрушение GFP и последующее наблюдение за повторным заселением в обесцвеченную область может раскрыть информацию о партнерах по взаимодействию белков, непрерывности органелл и трафике белков. ^[4]

Если через некоторое время флуоресценция больше не достигает начального уровня, то некоторая часть флуоресценции вызвана неподвижной фракцией (которая не может быть восполнена диффузией). Аналогично, если флуоресцентные белки связываются со статическими клеточными рецепторами, скорость восстановления будет замедлена фактором, связанным с коэффициентами ассоциации и диссоциации связывания. Это наблюдение совсем недавно было использовано для исследования связывания белков. ^{[3] [5] [6]} Аналогично, если белок, меченый GFP, конститутивно включен в более крупный комплекс, динамика восстановления флуоресценции будет характеризоваться диффузией более крупного комплекса. ^[7]

FRAP также можно использовать для мониторинга белков вне мембраны. После того, как интересующий белок становится флуоресцентным, как правило, путем экспрессии в виде белка слияния GFP, конфокальный микроскоп используется для фотообесцвечивания и мониторинга области цитоплазмы , ^[3] митотического веретена , ядра или другой клеточной структуры. ^{[8] [9]} Затем можно построить график средней флуоресценции в этой области в зависимости от времени с момента фотообесцвечивания, и полученная кривая может дать кинетические коэффициенты, такие как коэффициенты для реакций связывания белка и/или коэффициент диффузии белка в среде, где он отслеживается. ^[10] Часто единственной рассматриваемой динамикой являются диффузия и взаимодействия связывания/несвязывания, однако, в принципе, белки также могут перемещаться посредством потока, т. е. подвергаться направленному движению, и это было очень рано обнаружено Аксельродом и др. ^[1] Это может быть связано с потоком цитоплазмы или нуклеоплазмы или транспортом вдоль нитей в клетке, таких как микротрубочки , молекулярными моторами .

Анализ наиболее прост, когда восстановление флуоресценции ограничено либо скоростью диффузии в обесцвеченную область, либо скоростью, с которой обесцвеченные белки отсоединяются от своих участков связывания в обесцвеченной области и заменяются флуоресцентным белком. Давайте рассмотрим эти два предела для распространенного случая обесцвечивания белка слияния GFP в живой клетке.

Для круглого пятна отбеливания радиуса и восстановления с преобладанием диффузии флуоресценция описывается уравнением, полученным Сумпасисом ^[11] (которое включает модифицированные функции Бесселя и )${\displaystyle w}$ ${\displaystyle I_{0}}$${\displaystyle I_{1}}$

${\displaystyle f(t)=e^{-2\tau _{D}/t}\left(I_{0}(2\tau _{D}/t)+I_{1}(2\tau _{D}/t)\right)}$

с характерной шкалой времени для диффузии, и - время. - нормализованная флуоресценция (стремится к 1 по мере стремления к бесконечности). Шкала времени диффузии для обесцвеченного пятна радиуса равна , где D - коэффициент диффузии.${\displaystyle \тау _{D}}$${\displaystyle т}$${\displaystyle f(t)}$${\displaystyle т}$${\displaystyle w}$${\displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}$

Обратите внимание, что это относится к мгновенному отбеливанию с профилем ступенчатой ​​функции, т. е. доля белка, которая, как предполагается, мгновенно отбеливается в момент времени , равна , а , для — расстояние от центра обесцвеченной области. Также предполагается, что восстановление можно смоделировать с помощью диффузии в двух измерениях, которая также является как однородной, так и изотропной. Другими словами, диффузия происходит в однородной среде, поэтому эффективная константа диффузии D везде одинакова, и что диффузия изотропна, т. е. происходит с одинаковой скоростью вдоль всех осей в плоскости.${\displaystyle f_{b}}$${\displaystyle т=0}$${\displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}$${\displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}$${\displaystyle r}$

На практике в камере ни одно из этих предположений не будет строго верным.

1. Отбеливание не будет мгновенным. Особенно если требуется сильное отбеливание большой площади, отбеливание может занять значительную часть времени диффузии . Тогда значительная часть отбеленного белка будет диффундировать из отбеленной области фактически во время отбеливания. Не принимая это во внимание, мы внесем значительную ошибку в D. ^{[12] [13] [14]}${\displaystyle \тау _{D}}$
2. Отбеленный профиль не будет радиальной ступенчатой ​​функцией. Если отбеленное пятно фактически является одним пикселем, то отбеливание как функция положения обычно будет ограничено дифракцией и определяться оптикой используемого конфокального лазерного сканирующего микроскопа . Это не радиальная ступенчатая функция, а также изменяется вдоль оси, перпендикулярной плоскости.
3. Клетки, конечно, трехмерны, а не двумерны, как и обесцвеченный объем. Пренебрежение диффузией из плоскости (мы принимаем ее за плоскость xy ) будет разумным приближением, только если флуоресценция восстанавливается преимущественно посредством диффузии в этой плоскости. Это будет верно, например, если цилиндрический объем обесцвечивается с осью цилиндра вдоль оси z и с этим цилиндрическим объемом, проходящим через всю высоту клетки. Тогда диффузия вдоль оси z не вызывает восстановления флуоресценции, поскольку весь белок обесцвечивается равномерно вдоль оси z , и поэтому пренебрежение ею, как это делает уравнение Сумпасиса, безвредно. Однако, если диффузия вдоль оси z действительно способствует восстановлению флуоресценции, то ее необходимо учитывать.
4. Нет никаких оснований ожидать, что цитоплазма или нуклеоплазма клетки будут полностью пространственно однородными или изотропными.

Таким образом, уравнение Сумпасиса является всего лишь полезным приближением, которое можно использовать, когда перечисленные выше предположения являются хорошими приближениями к истинной ситуации, и когда восстановление флуоресценции действительно ограничено временной шкалой диффузии . Обратите внимание, что тот факт, что уравнение Сумпасиса может быть адекватно подогнано к данным, не обязательно означает, что предположения верны и что диффузия доминирует над восстановлением.${\displaystyle \тау _{D}}$

Уравнение, описывающее флуоресценцию как функцию времени, особенно просто в другом пределе. Если большое количество белков связывается с сайтами в небольшом объеме, так что там сигнал флуоресценции доминирует над сигналом от связанных белков, и если это связывание находится в одном состоянии со скоростью выключения k _off , то флуоресценция как функция времени определяется как ^[15]

${\displaystyle f(t)=1-e^{-k_{\text{off}}t}}$

Обратите внимание, что восстановление зависит только от константы скорости развязывания, k _off . Оно не зависит от скорости связывания. Хотя оно зависит от ряда предположений ^[15]

1. Скорость включения должна быть достаточно большой для того, чтобы локальная концентрация связанного белка значительно превышала локальную концентрацию свободного белка, и, таким образом, позволяла нам пренебречь вкладом свободного белка в f .
2. Реакция представляет собой простую бимолекулярную реакцию, в которой белок связывается с локализованными участками, которые не перемещаются значительно во время восстановления.
3. Обмен происходит гораздо медленнее, чем диффузия (или любой другой транспортный механизм, отвечающий за подвижность), поскольку только тогда диффундирующая фракция быстро восстанавливается и затем действует как источник флуоресцентного белка, который связывает и заменяет связанный обесцвеченный белок и таким образом увеличивает флуоресценцию. При r — радиусе обесцвеченного пятна, это означает, что уравнение справедливо только в том случае, если связанное время жизни .${\displaystyle 1/k_{\text{off}}>>r^{2}/D}$

Если все эти предположения выполнены, то подгонка экспоненты к кривой восстановления даст константу скорости отсечения, k _off . Однако другие динамики могут давать кривые восстановления, похожие на экспоненты, поэтому подгонка экспоненты не обязательно означает, что восстановление доминирует простая бимолекулярная реакция. Один из способов отличить восстановление со скоростью, определяемой отсоединением, от восстановления, ограниченного диффузией, состоит в том, чтобы отметить, что скорость восстановления для восстановления, ограниченного отсоединением, не зависит от размера обесцвеченной области r , в то время как она масштабируется как , для восстановления, ограниченного диффузией. Таким образом, если отбеливаются малая и большая области, если восстановление ограничено отсоединением, то скорости восстановления будут одинаковыми для двух размеров обесцвеченной области, тогда как если восстановление ограничено диффузией, то оно будет намного медленнее для большей обесцвеченной области.${\displaystyle r^{-2}}$

В общем, восстановление флуоресценции не будет доминировать ни за счет простой изотропной диффузии, ни за счет единственной простой скорости развязывания. Будет как диффузия, так и связывание, и действительно, константа диффузии может быть неоднородной в пространстве, и может быть более одного типа участков связывания, и эти участки также могут иметь неравномерное распределение в пространстве. Процессы потока также могут быть важны. Это более сложное поведение подразумевает, что для описания данных требуется модель с несколькими параметрами; модели только с одной константой диффузии D или одной константой скорости развязывания k _off неадекватны.

Существуют модели как с диффузией, так и с реакцией. ^[2] К сожалению, одна кривая FRAP может предоставить недостаточно доказательств для надежной и уникальной подгонки (возможно, зашумленных) экспериментальных данных. Садег Заде и др. ^[16] показали, что кривые FRAP могут быть подогнаны с помощью различных пар значений константы диффузии и константы скорости он-реакции, или, другими словами, что подгонки к FRAP не являются уникальными. Это касается трехпараметрических (константа скорости он-реакции, константа скорости диссоциации и константа диффузии) подгонок. Подгонки, которые не являются уникальными, обычно бесполезны.

Таким образом, для моделей с несколькими параметрами одного эксперимента FRAP может быть недостаточно для оценки всех параметров модели. Тогда требуются дополнительные данные, например, путем обесцвечивания областей разного размера, ^[14] независимого определения некоторых параметров модели и т. д.

• Флуоресцентный микроскоп
• Фотообесцвечивание
• Потеря флуоресценции при фотообесцвечивании (FLIP)