Иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции

Класс биохимического теста invitro

Иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции ( FPIA ) — это класс биохимических тестов in vitro , используемых для быстрого обнаружения антител или антигенов в образцах. FPIA — это конкурентный гомогенный анализ , который состоит из простого метода подготовки и считывания, без необходимости этапов разделения или промывания.

Основой анализа является анизотропия флуоресценции , также известная как поляризация флуоресценции. Если флуоресцентная молекула неподвижна и подвергается воздействию плоскополяризованного света , она возбудится и, следовательно , испустит излучение обратно в поляризованную плоскость. Однако, если возбужденная флуоресцентная молекула находится в движении (вращательном или поступательном) в течение времени жизни флуоресценции, она испустит свет в направлении, отличном от направления плоскости возбуждения. Время жизни флуоресценции — это количество времени между моментом поглощения и моментом испускания флуоресценции.

Обычно скорость вращения молекулы указывает на ее размер. ^[1] Когда молекула с флуоресцентной меткой (трейсер) связывается с другой молекулой, вращательное движение изменится, что приведет к изменению интенсивности плоскополяризованного света, что приведет к изменению поляризации флуоресценции. ^[2] Иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции использует связанный с флуорофором антиген , который при связывании с интересующим антителом увеличит поляризацию флуоресценции. Изменение поляризации пропорционально количеству антигена в образце и измеряется анализатором поляризации флуоресценции. ^[3]

История

Поляризация флуоресценции была впервые обнаружена Ф. Вайгертом в 1920 году. Он экспериментировал с растворами флуоресцеина, эозина и других красителей при различных температурах и вязкостях. Наблюдая, что поляризация увеличивается с вязкостью растворителя и размером молекулы красителя, но уменьшается с ростом температуры, он сделал вывод, что поляризация увеличивается с уменьшением подвижности излучающих видов. ^[2] С 1925 по 1926 год Фрэнсис Перрен подробно изложил количественную теорию поляризации флуоресценции в нескольких значительных публикациях, которые остаются актуальными и по сей день. ^[2]

С момента вклада Перрена метод развился от определения изотерм связывания при строго контролируемых параметрах до изучения взаимодействий связывания антиген - антитело , малая молекула - белок и гормон - рецептор . ^[4] Иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции был впервые описан и использован в 1960-х годах. ^[5]^[6] Конкурентная гомогенная характеристика позволила автоматизировать иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции гораздо проще, чем другие методы иммуноферментного анализа, такие как радиоиммуноанализ или иммуноферментный анализ . ^[4]

Несмотря на то, что изначально этот метод использовался для изучения прямого взаимодействия, с середины 1990-х годов он был принят в высокопроизводительный скрининг (HTS) для содействия процессу разработки лекарственных препаратов путем изучения сложного ферментативного взаимодействия . ^[4]

Принцип

FPIA количественно определяет изменение поляризации флуоресценции реакционных смесей флуоресцентно-меченого трейсера, антигена образца и определенного антитела . Работа при фиксированной температуре и вязкости позволяет сделать поляризацию флуоресценции прямо пропорциональной размеру флуорофора. Свободный трейсер в растворе имеет более низкую поляризацию флуоресценции, чем связанный с антителом трейсер с более медленным броуновским движением . Трейсер и специфический антиген будут конкурировать за связывание с антителом, и если концентрация антигена низкая, больше трейсера будет связано с антителом, что приведет к более высокой поляризации флуоресценции, и наоборот. ^[7]

Традиционная процедура FPIA выполняется следующим образом:

Определенное количество образца добавляется в реакционный буфер.
Раствору дают прийти в равновесие при комнатной температуре в течение примерно двух минут.
Раствор оценивается в анализаторе поляризации флуоресценции для получения базовых измерений.
К раствору добавляется определенное количество антигена, конъюгированного с флуорофором.
Раствор снова приходит в равновесие примерно в течение двух минут.
Раствор снова оценивается с помощью анализатора поляризации флуоресценции.
Значение поляризации флуоресценции для раствора, содержащего трассер, сравнивается с базовой линией, а величина разницы пропорциональна количеству целевого аналита в образце. ^[1]

Приложения

FPIA стал жизнеспособным методом количественной оценки малых молекул в смесях, включая: пестициды , ^[8] микотоксины ^[9] в пищевых продуктах, фармацевтические соединения в сточных водах, ^[10] метаболиты в моче и сыворотке, указывающие на употребление наркотиков ( каннабиноиды , амфетамины , барбитураты , кокаин , бензодиазепины , метадон , опиаты и PCP ), ^[11]^[12] и различные токсины малых молекул . А также с анализом взаимодействий гормонов и рецепторов . ^[4]

Смотрите также

Ссылки

^ ab Nielsen K, Lin M, Gall D, Jolley M (сентябрь 2000 г.). "Иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции: обнаружение антител к Brucella abortus". Методы . 22 (1): 71–6. doi :10.1006/meth.2000.1038. PMID 11020320.
^ abc Jameson D (2003). «Поляризация флуоресценции: прошлое, настоящее и будущее». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 6 (3): 167–176. doi :10.2174/138620703106298347. PMID 12678695 – через ResearchGate.
^ Popelka S (1981). «Иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции II. Анализатор для быстрого и точного измерения поляризации флуоресценции с использованием одноразовых кювет». Clin Chem . 27 (7): 1198–1201. doi : 10.1093/clinchem/27.7.1198 . PMID 7016373.
^ abcd Lea WA, Simeonov A (январь 2011 г.). «Флуоресцентные поляризационные анализы в скрининге малых молекул». Мнение экспертов по исследованию лекарственных препаратов . 6 (1): 17–32. doi :10.1517/17460441.2011.537322. PMC 3277431. PMID 22328899 .
^ Ватанабе Ф. (1988). Теория и применение иммуноферментного анализа с поляризацией флуоресценции . Нью-Йорк: Plenum Press. С. 199–200.
^ Насир М (1999). «Флуоресцентная поляризация: аналитический инструмент для иммуноанализа и открытия лекарств». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 2 (4): 177–190. doi :10.2174/1386207302666220204192916. PMID 10469879. S2CID 20003324 – через ResearchGate.
^ Смит Д.С., Еремин С.А. (июль 2008 г.). «Иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции и родственные методы простого высокопроизводительного скрининга малых молекул». Аналитическая и биоаналитическая химия . 391 (5): 1499–507. doi :10.1007/s00216-008-1897-z. PMID 18264817. S2CID 24167641.
^ Еремин СА, Смит ДС (май 2003). "Иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции для определения пестицидов". Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 6 (3): 257–66. doi :10.2174/138620703106298301. PMID 12678704.
^ Maragos C (декабрь 2009 г.). «Иммуноферментный анализ микотоксинов с поляризацией флуоресценции: обзор». Токсины . 1 (2): 196–207. doi : 10.3390/toxins1020196 . PMC 3202780 . PMID 22069541.
^ Oberleitner L, Dahmen-Levison U, Garbe LA, Schneider RJ (май 2017 г.). «Применение иммуноферментного анализа с поляризацией флуоресценции для определения карбамазепина в сточных водах». Журнал по управлению окружающей средой . 193 : 92–97. doi : 10.1016/j.jenvman.2017.01.063. PMID 28192740.
^ Ramey KL, Kovacs SJ, Martin DE, Jorkasky DK (май 1998). «Результаты скрининга наркотиков в моче добровольцев в исследованиях клинической фармакологии I фазы: вводим ли мы себя в заблуждение?». Журнал клинической фармакологии . 38 (5): 413–6. doi :10.1002/j.1552-4604.1998.tb04445.x. PMID 9602952. S2CID 21496845.
^ Эдмондс Д. (12 декабря 2000 г.). «Диагностический метод иммуноферментного анализа с поляризацией флуоресценции US 6159750A». Google Patents . Получено 6 апреля 2017 г.

[:1-1] Nielsen K, Lin M, Gall D, Jolley M (сентябрь 2000 г.). "Иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции: обнаружение антител к Brucella abortus". Методы . 22 (1): 71–6. doi :10.1006/meth.2000.1038. PMID 11020320.

[:0-2] Jameson D (2003). «Поляризация флуоресценции: прошлое, настоящее и будущее». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 6 (3): 167–176. doi :10.2174/138620703106298347. PMID 12678695 – через ResearchGate.

[3] Popelka S (1981). «Иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции II. Анализатор для быстрого и точного измерения поляризации флуоресценции с использованием одноразовых кювет». Clin Chem . 27 (7): 1198–1201. doi : 10.1093/clinchem/27.7.1198 . PMID 7016373.

[:2-4] Lea WA, Simeonov A (январь 2011 г.). «Флуоресцентные поляризационные анализы в скрининге малых молекул». Мнение экспертов по исследованию лекарственных препаратов . 6 (1): 17–32. doi :10.1517/17460441.2011.537322. PMC 3277431. PMID 22328899 .

[5] Ватанабе Ф. (1988). Теория и применение иммуноферментного анализа с поляризацией флуоресценции . Нью-Йорк: Plenum Press. С. 199–200.

[6] Насир М (1999). «Флуоресцентная поляризация: аналитический инструмент для иммуноанализа и открытия лекарств». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 2 (4): 177–190. doi :10.2174/1386207302666220204192916. PMID 10469879. S2CID 20003324 – через ResearchGate.

[7] Смит Д.С., Еремин С.А. (июль 2008 г.). «Иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции и родственные методы простого высокопроизводительного скрининга малых молекул». Аналитическая и биоаналитическая химия . 391 (5): 1499–507. doi :10.1007/s00216-008-1897-z. PMID 18264817. S2CID 24167641.

[8] Еремин СА, Смит ДС (май 2003). "Иммуноферментный анализ с поляризацией флуоресценции для определения пестицидов". Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 6 (3): 257–66. doi :10.2174/138620703106298301. PMID 12678704.

[9] Maragos C (декабрь 2009 г.). «Иммуноферментный анализ микотоксинов с поляризацией флуоресценции: обзор». Токсины . 1 (2): 196–207. doi : 10.3390/toxins1020196 . PMC 3202780 . PMID 22069541.

[10] Oberleitner L, Dahmen-Levison U, Garbe LA, Schneider RJ (май 2017 г.). «Применение иммуноферментного анализа с поляризацией флуоресценции для определения карбамазепина в сточных водах». Журнал по управлению окружающей средой . 193 : 92–97. doi : 10.1016/j.jenvman.2017.01.063. PMID 28192740.

[11] Ramey KL, Kovacs SJ, Martin DE, Jorkasky DK (май 1998). «Результаты скрининга наркотиков в моче добровольцев в исследованиях клинической фармакологии I фазы: вводим ли мы себя в заблуждение?». Журнал клинической фармакологии . 38 (5): 413–6. doi :10.1002/j.1552-4604.1998.tb04445.x. PMID 9602952. S2CID 21496845.

[12] Эдмондс Д. (12 декабря 2000 г.). «Диагностический метод иммуноферментного анализа с поляризацией флуоресценции US 6159750A». Google Patents . Получено 6 апреля 2017 г.