Волоконная фотометрия

В этой статье есть несколько проблем. Помогите улучшить ее или обсудите эти проблемы на странице обсуждения . ( Узнайте, как и когда удалять эти сообщения ) Эта статья может оказаться слишком сложной для понимания большинством читателей .Пожалуйста, помогите улучшить его, чтобы сделать его понятным для неспециалистов , не удаляя технические детали. ( Январь 2022 )( Узнайте, как и когда удалить это сообщение ) This article's use of external links may not follow Wikipedia's policies or guidelines. Please improve this article by removing excessive or inappropriate external links, and converting useful links where appropriate into footnote references. (January 2022) (Learn how and when to remove this message) (Learn how and when to remove this message)

Волоконная фотометрия — это метод визуализации кальция , который фиксирует «объемную» или популяционную активность кальция (Ca ²⁺ ) ^[1] из определенных типов клеток в области мозга или функциональной сети с целью изучения нейронных цепей ^{[2] [3] [4] [5] [6]} Популяционную активность кальция можно соотнести с поведенческими задачами, такими как пространственное обучение, вызов памяти и целенаправленное поведение. ^[7] Метод включает хирургическую имплантацию волоконной оптики в мозг живых животных. Преимущества для исследователей заключаются в том, что оптические волокна проще имплантировать, они менее инвазивны и менее дороги, чем другие методы исследования кальция, и животное испытывает меньший вес и нагрузку по сравнению с минископами. Он также позволяет визуализировать несколько взаимодействующих областей мозга и интегрировать с другими методами нейронауки. Ограничениями волоконной фотометрии являются низкое клеточное и пространственное разрешение, а также тот факт, что животные должны быть надежно привязаны к жесткому пучку волокон, что может повлиять на естественное поведение более мелких млекопитающих, таких как мыши.

Фотометрия волокон основана на экспрессии генетически кодируемых кальциевых индикаторов (GECI), таких как GCaMP или RCaMP, которые могут быть нацелены на определенные клетки с использованием клеточно-специфичных промоутеров, таких как Ca2+/кальмодулин-зависимая протеинкиназа II (CaMKII) и человеческий синапсин (hSyn), которые обеспечивают возбуждающую нейрональную и паннейрональную экспрессию соответственно. ^[1] Эти промоутеры могут быть использованы для нацеливания на различные нейрональные подтипы, а также на ненейрональные клетки, которые демонстрируют динамику кальция, такие как астроциты , с использованием промоутера глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) . ^{[8] [9] [10] [11]} Как в нейронах, так и в астроцитах клеточная активность в форме потенциалов действия, экзоцитоза нейротрансмиттеров, изменений синаптической пластичности и транскрипции генов связана с притоком ионов Ca2 ^{+ . [5]}

Эти зависящие от активности изменения внутриклеточных уровней кальция можно отслеживать, вводя GECI в клетку. После этого притока ионов GECI флуоресцируют при связывании Ca ²⁺ , и изменение флуоресценции пропорционально соответствует изменениям внутриклеточного кальция. ^[12] Наиболее часто используемым индикатором кальция для волоконной фотометрии (и других методов визуализации in vivo ) является GCaMP6, хотя продолжают разрабатываться дополнительные GECI с уникальными спектрами флуоресценции, кинетикой, соотношением сигнал-шум и чувствительностью к кальцию. ^{[13] [14]} Эти индикаторы могут быть выражены в мозге двумя основными способами: вирусная экспрессия ^[15] и трансгенные линии мышей . ^[16] В последнее время растет список индикаторов, которые стали доступны для измерения различных химических сигналов, например, dLight для регистрации сигналов дофамина или OxLight для регистрации орексина . ^{[15] [17] [18]} GCaMP, RCaMP, dLight и другие индикаторы возбуждаются источником света на оптимальной длине волны и излучают в ответ собственный свет, что позволяет регистрировать динамику кальция или нейротрансмиттеров с течением времени. ^{[15] [19] [13] [3] [20] [21]}

Системы волоконной фотометрии предназначены для доставки точных длин волн возбуждения света, специфичных для кальциевого (например, GCaMP) или нейротрансмиттерного индикатора (например, dLight). ^[3] Этот свет проходит по оптоволокну к оптоволокну, которое имплантировано в интересующую область мозга или области. Индикатор кальция, который экспрессируется специфическим для типа клеток образом, возбуждается этим светом и, в свою очередь, испускает свой собственный сигнал, который возвращается обратно через то же волокно. ^{[3] [4] [22]} Эти собранные сигналы излучения спектрально разделяются дихроичным зеркалом, пропускаются через фильтр и фокусируются на фотодетекторе, научной камере или ФЭУ. ^[3] Собранный сигнал представляет собой изменение флуоресценции (ΔF) относительно исходного базового уровня (F). В свою очередь, исследователи могут наблюдать сигнал, который соответствует кальциевым переходным процессам (ΔF/F). Эти данные временного ряда можно анализировать с помощью различных конвейеров с открытым исходным кодом, таких как pMAT, ^[23] pyPhotometry ^[24] и GuPPy. ^[25]

Важно отметить, что изобестические сигналы являются кальций-независимыми сигналами (т. е. приблизительно 405-415 нм), которые контрастируют с кальций-зависимой длиной волны (т. е. 470 нм для GCaMP). Поскольку GCaMP имеет два состояния, связанный и несвязанный Ca ^{2+ , две конформации белка имеют уникальные спектры возбуждения и испускания. Длина волны возбуждения, при которой GCaMP имеет одинаковую поглощательную способность с и без Ca 2+,} является изобестической и определяет базовую линию кальций-независимой флуоресценции. Движение животных и аутофлуоресценция тканей отражаются в этом кальций-независимом сигнале и могут быть вычтены или регрессированы для выявления истинного изменения флуоресценции. ^[26]

Оптимальная экспрессия генетически кодируемых индикаторов кальция (GECI) может быть достигнута двумя способами: аденоассоциированными вирусными векторами и трансгенными линиями грызунов . ^{[15] [16]} Вирусная инъекция требует инфузии GECI в интересующую область мозга. ^[15] Этот вирус может быть нацелен на инфицирование уникальных типов клеток с помощью клеточно-специфических промоторов, таких как CaMKII и GFAP, для нацеливания на возбуждающие нейроны и астроциты соответственно. Это позволяет регистрировать нейронную активность из генетически определенной субпопуляции нейронов или глиальных клеток через имплантированное оптическое волокно. ^[1] Вирусная экспрессия требует титрования разведений для получения оптимальной экспрессии в мозге, что может быть необходимо вместо использования трансгенных линий грызунов для определенных экспериментов. Экспрессия GECI также может быть достигнута с помощью трансгенных линий, которые обеспечивают повсеместную экспрессию по всему мозгу. В зависимости от штамма мыши или крысы экспрессия может различаться в разных областях мозга, что создает потенциальные проблемы во время записи. ^[16]

GCaMP — это генетически кодируемый индикатор кальция (GECI), который обычно используется в нескольких методах визуализации. ^[19] GCaMP испускает флуоресценцию, когда индикатор связан с ионом кальция (Ca ²⁺ ). Этот кальциевый сигнал напрямую связан с паттернами нейронного ответа, высвобождением нейротрансмиттера и возбудимостью мембраны. ^[27] Длины волн возбуждения для GCaMP и его изосбестического сигнала составляют приблизительно 470 нм и 415 нм (синий) соответственно. Цель состоит в том, чтобы фотовозбудить точки максимального поглощения и изосбестические точки индикатора. Изосбестическая точка GCaMP — это кальций-независимый сигнал, приблизительно 405-415 нм. Это определяется на основе того, что GCaMP имеет два функциональных состояния, связанное и несвязанное с ионами кальция. Эти два состояния имеют уникальные спектры возбуждения и испускания белка. Длина волны возбуждения, при которой эти два состояния белка имеют одинаковую поглощательную способность, является изосбестической точкой и определяет базовую флуоресценцию. Движение и автофлуоресценция отражаются в этом кальций-независимом сигнале и могут быть вычтены или регрессированы, чтобы выявить истинное изменение клеточной флуоресценции во время поведенческой задачи или экспериментальной манипуляции. ^[26]

Длина волны излучения GCaMP составляет приблизительно 525 нм (зеленый цвет), ее можно анализировать и коррелировать с течением времени во время поведенческих задач.

Для наблюдения одновременной динамики кальция в нескольких типах клеток исследователи объединили два или более GECI в одной области мозга. ^{[3] [28]} Например, исследовательская группа зарегистрировала флуоресценцию от зеленых и красных GECI, GCaMP6f и jRGECO1a, которые были дифференциально выражены в шипиковых проекционных нейронах прямого и непрямого пути полосатого тела у свободно ведущих себя мышей. ^[29] Экспрессия нескольких GECI в одной и той же области мозга может быть выполнена не только в двух наборах нейронов, как показано в предыдущем исследовании. Эти одновременные записи объемного кальция также могут быть выполнены с несколькими типами клеток, такими как нейроны и астроциты. Эти типы клеток экспрессируют уникальные промоторы, такие как GFAP и hSyn, и GECI могут быть целенаправленно нацелены таким образом. Другая исследовательская группа провела успешную двухцветную фотометрию волокон с использованием промоутеров, специфичных для астроцитов и нейронов, в то время как мыши свободно выполняли задание на рабочую память (T-лабиринт). ^[30]

Целью волоконной фотометрии является точная доставка, извлечение и запись объемного кальциевого сигнала из определенных популяций клеток в интересующей области мозга. Для доступа к сигналу оптическая канюля/волокно должны быть хирургически имплантированы в место экспрессии GECI. Это оптическое волокно может собирать только кальциевый сигнал на уровне популяции, а не активность отдельных клеток. ^[1] Кроме того, оптические волокна позволяют производить запись как из глубоких, так и из поверхностных структур мозга и минимизировать повреждение тканей в отличие от линз GRIN или кортикальных окон.

GCaMP имеет специфические спектры возбуждения и испускания приблизительно при 470 нм и 530 нм соответственно. ^[27] Светодиодные источники света являются одними из наиболее часто выбираемых из-за низкой оптической мощности, необходимой для возбуждения GECI. Правильная передача сигналов возбуждения и испускания в двух направлениях от мозга к устройству формирования изображения координируется дихроичными зеркалами и фильтрами возбуждения/испускания. Существует три различных типа устройств формирования изображения: фотодетекторы , фотоэлектронные умножители (ФЭУ) и научные камеры . При сборе сигнала из одной области мозга обычно используют фотодетектор или ФЭУ из-за их быстрого получения и низкого отношения сигнал/шум (SNR). В качестве альтернативы при сборе из нескольких областей мозга необходимо использовать научные камеры или несколько фотодетекторов или ФЭУ.

В целом, эта система позволяет соединить оптическую канюлю, источник света и устройство формирования изображения. Точная доставка света в GECI обеспечивается оптической канюлей/волокном, а сигнал излучения собирается устройством формирования изображения во время записи.

Некоторые примеры коммерчески доступных систем волоконной фотометрии включают Neurophotometrics, Inscopix и MightexBio.

Все научные методы имеют соображения, которые необходимо учитывать перед использованием. Волоконная фотометрия имеет много преимуществ по сравнению с другими методами визуализации кальция, но она имеет ограничения.

Для людей в лабораториях, которые хотят интегрировать визуализацию кальция в свои эксперименты, но пока не имеют финансовых или технических возможностей для этого, волоконная фотометрия является низким барьером для входа. Оптические волокна проще имплантировать, они менее инвазивны и более недороги, чем другие методы исследования кальция, такие как одно- или двухфотонная визуализация. ^[14] Это хорошо для продольных ^[31] поведенческих парадигм, поскольку по сравнению с минископами вес и нагрузка на животное меньше. Это ограничивает подвижность животного значительно меньше, чем другие методы, позволяя более свободно двигаться, естественное поведение в более крупных моделях грызунов. Это универсальная техника, позволяющая визуализировать несколько взаимодействующих областей мозга и интегрировать с оптогенетикой, ^[32] электрофизиологией ^[33] и другими методами нейронауки системного уровня. В последнее время эту технику можно сочетать с другими флуоресцентными индикаторами активности нейротрансмиттеров или изменений pH. ^{[15] [21]}

При планировании экспериментов важно учитывать основное ограничение волоконной фотометрии: низкое клеточное и пространственное разрешение. Этот недостаток оптического разрешения можно объяснить сбором агрегации активности в поле зрения, что позволяет проводить только «массовые» изменения флуоресцентного сигнала. ^[5] Хотя размер оптической канюли намного меньше, чем у технологий, используемых в других методах визуализации кальция, таких как одно- и двухфотонная микроскопия, животные должны быть надежно привязаны к жесткому пучку волокон. ^[1] Это может ограничить естественное поведение и поведение более мелких млекопитающих, таких как мыши.

Волоконная фотометрия может быть интегрирована с клеточной манипуляцией для установления причинно-следственной связи между нейронной активностью и поведением. Целенаправленная модуляция определенных типов клеток и проекций в мозге может быть достигнута с помощью оптогенетики или дизайнерских рецепторов, активируемых исключительно дизайнерскими препаратами (DREADD) . ^[14] Метод выбирается на основе временной точности, необходимой для экспериментального дизайна, среди прочих факторов. Оптогенетика позволяет манипулировать определенным типом клеток с высокой временной точностью. DREADD имеют гораздо более низкую временную точность из-за фармакокинетики лиганда, такого как клозапин-N-оксид (CNO) ^[34] или десхлорклозапин (DCZ). ^[35] Важно отметить, что одновременное оптическое считывание и оптогенетическая манипуляция сопряжены с несколькими потенциальными проблемами, которые обсуждаются ниже. ^[32]

Кроме того, волоконная фотометрия может быть объединена с электрофизиологией in vivo в пределах одного и того же животного. ^[33] При объединении эта комбинация электрофизиологической регистрации и кальциевой визуализации может использоваться для наблюдения за специфической активностью типа клеток с более высокой временной точностью считывания потенциалов действия нейронов в свободно ведущих себя моделях животных.

Доставка и экспрессия оптогенетических зондов и кальциевых индикаторов в одни и те же нейроны может создавать проблемы. Кальциевые индикаторы и каналы манипуляции могут иметь перекрывающиеся спектры возбуждения, такие как GCaMP и каналродопсин (ChR2) , которые оба имеют пиковую длину волны возбуждения приблизительно 470 нм. Возбуждение кальциевого индикатора может потенциально активировать оптогенетический светочувствительный ионный канал. Измеренное изменение кальциевого сигнала не может быть легко отнесено к фактическим изменениям кальция или оптогенетически вызванному сигналу. Решения этой проблемы включают комбинацию индикаторов, которые имеют неперекрывающийся спектр возбуждения с вашим оптогенетическим зондом или кальциевым индикатором. Кальциевые индикаторы (GCaMP, RCaMP) и оптогенетические зонды для возбуждения (ChR2, Crimson) и ингибирования ( eNpHR , Arch , Jaws) являются вариантами для этого.

Минископы ^{[36] [37] [38] [39]} — это миниатюрные микроскопы, устанавливаемые на голове, которые позволяют получать изображения больших популяций нейронной активности у свободно ведущих себя мышей и крыс. Это возможно благодаря их небольшому размеру, поскольку они достаточно легкие, чтобы мышь или крыса могли легко их переносить, не сильно влияя на поведение. Исследователи соединяют минископы с имплантированными линзами с градиентным показателем преломления (GRIN) или корковыми окнами, которые позволяют получать глубокие и поверхностные изображения мозга. ^{[38] [5] [40]} Этот метод идеально подходит для мониторинга активности сотен генетически и пространственно определенных клеток в пределах одного животного. ^[37] По сравнению с волоконной фотометрией минископы позволяют получать изображения с высоким клеточным разрешением, обнаруживая изменения кальция в отдельных нейронах и не нейронных клетках. ^[36] Кроме того, этот метод позволяет получать повторные изображения с течением времени для анализа перехода от «здорового» к патологическому состоянию или изменения в ходе поведения. ^[37] Однако этот метод визуализации имеет низкую чувствительность и высокий уровень шума, что обеспечивает получение изображений с более низким разрешением по сравнению с другими многофотонными методами, такими как двухфотонный. ^[7] Эти миниатюрные микроскопы ограничены в своей способности обнаруживать индикаторы со смещением в дальнюю красную область, которые были бы необходимы для комбинации оптогенетики и визуализации кальция, как обсуждалось выше.

Двухфотонная визуализация ^{[41] [5]} — еще один метод визуализации кальция, который регистрирует колебания в динамике клеточного GECI. Он позволяет проникать в сильно рассеивающую свет мозговую ткань на глубину до 600–700 микрон под поверхностью мозга. ^{[36] [42]} По сравнению с другими методами двухфотонная визуализация обеспечивает более высокое клеточное и субклеточное пространственное разрешение, например, внутри дендритов и аксональных отростков в четко определенной фокальной плоскости. ^{[36] [41]} Однако без помощи оптической канюли или микроэндоскопа этот метод ограничен более поверхностными областями мозга. ^{[36] [43] [44]} Этот тип визуализации также требует, чтобы голова животных оставалась зафиксированной, что ограничивает естественное поведение, необходимое для некоторых сложных поведенческих задач. ^{[41] [36]}