Культура с подпиткой
 | This article may be in need of reorganization to comply with Wikipedia's layout guidelines. (April 2014) |
Подпитываемая периодическая культура в самом широком смысле определяется как операционная техника в биотехнологических процессах, где одно или несколько питательных веществ (субстратов) подаются (поставляются) в биореактор во время культивирования и в котором продукт(ы) остаются в биореакторе до конца цикла. [1] Альтернативное описание метода - это культура, в которой «базовая среда поддерживает начальную культуру клеток , а питательная среда добавляется для предотвращения истощения питательных веществ». [2] Это также тип полупериодической культуры . В некоторых случаях все питательные вещества подаются в биореактор. Преимущество подпитываемой периодической культуры заключается в том, что можно контролировать концентрацию подпитываемого субстрата в культуральной жидкости на произвольно желаемых уровнях (во многих случаях на низких уровнях).
В целом, периодическое культивирование с подпиткой превосходит традиционное периодическое культивирование, когда контроль концентрации питательного вещества (или питательных веществ) влияет на выход или продуктивность желаемого метаболита.
Типы биопроцессов
Типы биопроцессов, для которых эффективна культура с подпиткой, можно обобщить следующим образом:
1. Ингибирование субстрата [1]
Питательные вещества, такие как метанол, этанол, уксусная кислота и ароматические соединения, подавляют рост микроорганизмов даже при относительно низких концентрациях. При правильном добавлении таких субстратов время задержки может быть сокращено, а ингибирование роста клеток заметно снижено.
2. Высокая плотность клеток (высокая концентрация клеток) [1]
В периодической культуре для достижения очень высоких концентраций клеток, например, 50-100 г сухих клеток/л, необходимы высокие начальные концентрации питательных веществ в среде. При таких высоких концентрациях питательные вещества становятся ингибирующими, хотя они не оказывают такого эффекта при обычных концентрациях, используемых в периодической культуре.
3. Эффект глюкозы ( эффект Крэбтри ) [1]
При производстве пекарских дрожжей из солодового сусла или патоки с начала 1900-х годов было признано, что этанол производится даже при наличии достаточного количества растворенного кислорода (РК), если в культуральной жидкости присутствует избыток сахара. Этанол является основной причиной низкого выхода клеток. Аэробное образование этанола в присутствии концентрации глюкозы известно как эффект глюкозы или эффект Крэбтри. Чтобы уменьшить этот эффект, для производства пекарских дрожжей обычно используется процесс с подпиткой. В аэробных культурах Escherichia coli и Bacillus subtilis органические кислоты, такие как уксусная кислота (и в меньших количествах молочная кислота и муравьиная кислота), производятся в качестве побочных продуктов при высокой концентрации сахара, и эти кислоты подавляют рост клеток, а также оказывают ухудшающее воздействие на метаболическую активность. Образование этих кислот называется бактериальным эффектом Крэбтри.
4. Катаболитная репрессия [1]
Когда микроорганизму предоставляется быстро метаболизируемый источник углеродной энергии, такой как глюкоза, результирующее увеличение внутриклеточной концентрации АТФ приводит к подавлению биосинтеза фермента(ов), тем самым вызывая более медленную метаболизацию источника энергии. Это явление известно как катаболитная репрессия. Многие ферменты, особенно те, которые участвуют в катаболических путях, подвержены этой репрессивной регуляции. Эффективным методом преодоления катаболитной репрессии в биосинтезе ферментов является культура с подпиткой, в которой концентрация глюкозы в культуральной жидкости поддерживается на низком уровне, где рост ограничен, а биосинтез фермента дерепрессируется. Медленная подача глюкозы при ферментации пенициллина Penicillium chrysogenum является классическим примером в этой категории.
5. Ауксотрофные мутанты [1]
В микробном процессе, использующем ауксотрофный мутант (мутант, требующий питательных веществ), избыточное снабжение необходимыми питательными веществами приводит к обильному росту клеток с небольшим накоплением желаемого метаболита из-за ингибирования обратной связи и/или репрессии конечного продукта. Однако голодание необходимыми питательными веществами снижает рост клеток, а также общую выработку желаемого метаболита, поскольку скорость выработки обычно пропорциональна концентрации клеток. В таком биопроцессе накопление желаемого метаболита может быть максимизировано путем выращивания мутанта на ограниченном количестве требуемого питательного вещества. Чтобы культивировать мутант на низкой концентрации требуемого питательного вещества, его подают в периодическую культуру с контролируемой скоростью. Этот метод часто используется в промышленном производстве аминокислот с ауксотрофными мутантами. Примером является производство лизина с мутантом Corynebacterium glutamicum, требующим гомосерина или треонина/метионина, у которого отсутствует ген гомосериндегидрогеназы.
6. Контроль экспрессии гена с репрессируемым промотором
Транскрипция гена, имеющего репрессируемый промотор выше открытой рамки считывания , репрессируется комбинацией так называемого голо-репрессора с операторной областью на ДНК. Когда в культуральной жидкости присутствует указанное химическое соединение, соединение (или его метаболит) в клетках объединяется как корепрессор с апо-репрессором (видом фактора транскрипции), образуя голо-репрессор. Поддержание концентрации этого соединения на максимально низком уровне (при этом обеспечивая достаточный рост клеток) позволяет продолжить экспрессию регулируемого гена. Культура с подпиткой является мощным методом для этого. Примерами репрессируемого промотора являются промотор trp и промотор phoA .
7. Увеличение времени работы, восполнение потерь воды при испарении и снижение вязкости культурального бульона [1]
Типы стратегий культивирования
Культура с высокой плотностью клеток
Стратегия подпитки-партии обычно используется в биопромышленных процессах для достижения высокой плотности клеток в биореакторе . [3] [4] [5] [6] В основном питающий раствор имеет высокую концентрацию, чтобы избежать разбавления биореактора. Производство гетерологичных белков культурами подпитки-партии рекомбинантных микроорганизмов было тщательно изучено. [7] [8] [9] [10]
Контролируемое добавление питательных веществ напрямую влияет на скорость роста культуры и помогает избежать избыточного метаболизма (образования побочных метаболитов, таких как ацетат для Escherichia coli , молочная кислота в культурах клеток млекопитающих, этанол в Saccharomyces cerevisiae ), ограничения кислорода (анаэробиоз). [11] [12]
Постоянно-подпитываемая периодическая культура
Простейшая культура с подпиткой — это та, в которой скорость подачи субстрата, ограничивающего рост, постоянна, т. е. скорость подачи неизменна в течение культивирования. Этот случай показан на графике (здесь объем культуры является переменным). Этот тип культуры с подпиткой называется культурой с постоянной подпиткой (CFBC) и хорошо обоснован математически [13] и экспериментально. [14] В CFBC были изучены оба случая CFBC с фиксированным объемом и CFBC с переменным объемом.
Экспоненциально-периодическая культура с подпиткой
В идеальных условиях клетки растут экспоненциально. Если скорость подачи ограничивающего рост субстрата увеличивается пропорционально экспоненциальной скорости роста клеток, то можно поддерживать удельную скорость роста клеток в течение длительного времени, сохраняя при этом концентрацию субстрата в культуральной жидкости на постоянном уровне. Требуемая скорость подачи (объемная или массовая) должна увеличиваться экспоненциально со временем, поэтому этот режим культивирования с подпиткой называется культурой с экспоненциальной подпиткой (EFBC). [15]
Ограничение субстрата дает возможность контролировать скорости реакции, чтобы избежать технологических ограничений, связанных с охлаждением реактора и переносом кислорода. Ограничение субстрата также позволяет осуществлять метаболический контроль, чтобы избежать осмотических эффектов, репрессии катаболитов и избыточного метаболизма побочных продуктов. [16] [17] [18]
Стратегия контроля
Для контроля роста в периодическом процессе с подпиткой можно использовать различные стратегии:
| Параметр управления | Принцип управления |
|---|---|
| ДОТ ( pO2 ) | DOstat (DOT= константа), F~DOT |
| Скорость поглощения кислорода (OUR) | OUR=константа, F~OUR |
| Глюкоза | измерение уровня глюкозы в режиме реального времени (FIA), уровень глюкозы=константа |
| Ацетат | измерение ацетата в режиме реального времени (FIA), ацетат=константа |
| pH (pHстат) | F~pH (закисление связано с высоким уровнем глюкозы) |
| Аммиак | измерение аммиака в режиме реального времени (FIA), аммиак=константа |
| Температура | T адаптировано в соответствии с OUR или p O 2 |
Ссылки
- ^ Цунео Яманэ, Сёити Симидзу: Методы периодического культивирования с подпиткой в микробных процессах. Advances in Biochem Eng./Biotechnol 1984, 30:147-194.
- ^ Ngibuini, Mwai (25 ноября 2014 г.). «Как одноразовые мини-биореакторы могли бы революционизировать масштабирование биопроцессов». Фармацевтическая обработка . Соединенные Штаты: Advantage Business Media. Архивировано из оригинала 20 октября 2015 г. Получено 28 ноября 2014 г.
- ^ Дитер Ризенберг: Культивирование Escherichia coli с высокой плотностью клеток . Curr Opin Biotechnol 1991, 2:380-384.
- ^ L. Yee, Harvey W. Blanch: Экспрессия рекомбинантного белка в культурах Escherichia coli с высокой плотностью клеток . Bio/Technology (NY) 1992, 10:1550-1556.
- ^ Сан Юп Ли: Культура Escherichia coli с высокой плотностью клеток . Trends Biotechnol 1996, 14:98-105.
- ^ Джозеф Шилоах, Рефаэль Фасс: Выращивание E. coli до высокой плотности клеток — историческая перспектива развития метода. Biotechnol Adv 2005, 23:345-357.
- ^ O Mendoza-Vega, J. Sabatie, SW Brown: Промышленное производство гетерологичных белков с помощью подпитываемых культур дрожжей Saccharomyces-cerevisiae . FEMS Microbiology Reviews 1994, 15:369-410.
- ^ Паулина Балбас: Понимание искусства производства белковых и небелковых молекул в Escherichia coli. Молекулярная биотехнология 2001, 19:251-267.
- ^ Neubauer P, Winter J: Стратегии экспрессии и ферментации для получения рекомбинантного белка в Escherichia coli . В: Merten OW et al. (Eds). Производство рекомбинантного белка с использованием прокариотических и эукариотических клеток. Сравнительный взгляд на физиологию хозяина. 2001, Kluwer Academic Publisher, Дордрехт, Нидерланды. С. 195-258.
- ^ Амуля К. Панда: Биообработка терапевтических белков из включений тел Escherichia coli . Adv Biochem Eng Biotechnol 2003, 85:43-93.
- ^ Чонсок Ли, Сан Ёп Ли, Сувон Парк, Антон П. Дж. Миддельберг: Управление ферментацией с подпиткой. Biotechnol Adv 1999, 17:29-48.
- ^ Кэти Ф. Влашин, Вэй-Шоу Ху: Культура с подпиткой и динамическое питание питательными веществами. Adv Biochem Engin/Biotechnol 2006, 101:43-74.
- ^ Цунео Яманэ, Шигеки Хирано: Полупериодическое культивирование микроорганизмов с постоянной подачей субстрата — математическое моделирование. J Ferment Technol 1977, 55:156-165.
- ^ Цунео Яманэ, Шигеки Хирано: Полупериодическое культивирование микроорганизмов с постоянной подачей субстрата - Экспериментальное исследование -. J Ferment Technol 1977, 55:380-387.
- ^ Цунео Яманэ, Мичимаса Кишимото, Фумитаке Ёсида: Полупериодическое культивирование бактерий, ассимилирующих метанол, с экспоненциально увеличенной подачей метанола. J Ferment Technol 1974, 54:229-240.
- ^ J. Zhang, Randolph Greasham: Химически определенные среды для коммерческих ферментаций. Прикладная микробиология и биотехнология 1999, 51:407-421.
- ^ Гуннар Лиден: Понимание биореактора. Биопроцессная и биосистемная инженерия 2002, 24:273-279.
- ^ Кристофер Дж. Хьюитт, Элвин В. Нинов : Масштабирование процессов микробной периодической ферментации и ферментации с подпиткой. Adv Appl Microbiol 2007, 62:105-135.
