Эпистаз и функциональная геномика

Эпистаз относится к генетическим взаимодействиям, при которых мутация одного гена маскирует фенотипические эффекты мутации в другом локусе . [1] Систематический анализ этих эпистатических взаимодействий может дать представление о структуре и функции генетических путей. Изучение фенотипов, возникающих в результате пар мутаций, помогает понять, как пересекаются функции этих генов. Генетические взаимодействия обычно классифицируются как положительные/смягчающие или отрицательные/усугубляющие. Эпистаз приспособленности (взаимодействие между неаллельными генами ) является положительным (другими словами, уменьшающим, антагонистическим или буферным), когда мутация потери функции двух данных генов приводит к превышению приспособленности, предсказанной на основе индивидуальных эффектов вредных мутаций, и отрицательным (то есть усиливающим, синергетическим или усугубляющим), когда он снижает приспособленность. [2] Рышард Корона и Лукас Яснос показали, что эпистатический эффект обычно положителен в Saccharomyces cerevisiae . Обычно, даже в случае положительных взаимодействий двойной мутант имеет меньшую приспособленность, чем одиночные мутанты. [2] Положительные взаимодействия часто происходят, когда оба гена лежат в одном и том же пути [3] Наоборот, отрицательные взаимодействия характеризуются еще более сильным дефектом, чем можно было бы ожидать в случае двух одиночных мутаций, и в самых крайних случаях (синтетический больной/летальный) двойная мутация летальна. Этот усугубленный фенотип возникает, когда гены в компенсаторных путях оба нокаутированы .

Высокопроизводительные методы анализа этих типов взаимодействий были полезны для расширения наших знаний о генетических взаимодействиях. Синтетические генетические массивы (SGA), диплоидный синтетический анализ летальности на микромассивах (dSLAM) и эпистатические профили мини-массивов (E-MAP) — три важных метода, которые были разработаны для систематического анализа и картирования генетических взаимодействий. Этот систематический подход к изучению эпистаза в масштабе всего генома имеет значительные последствия для функциональной геномики . Выявляя отрицательные и положительные взаимодействия между неизвестным геном и набором генов в пределах известного пути, эти методы могут прояснить функцию ранее не охарактеризованных генов в контексте метаболического или развивающего пути.

Функция вывода: смягчающие и усугубляющие мутации

Чтобы понять, как информация об эпистатических взаимодействиях связана с генными путями, рассмотрим простой пример дифференциации клеток вульвы у C. elegans . Клетки дифференцируются из клеток Pn в клетки Pn.p, затем в клетки VP и в клетки вульвы. Мутация lin-26 [4] блокирует дифференциацию клеток Pn в клетки Pn.p. Мутанты lin-36 [5] ведут себя схожим образом, блокируя дифференциацию при переходе к клеткам VP. В обоих случаях полученный фенотип характеризуется отсутствием клеток вульвы, поскольку в пути дифференциации имеется восходящий блок. Двойной мутант, в котором оба этих гена были нарушены, демонстрирует эквивалентный фенотип, который не хуже, чем любой из одиночных мутантов. Восходящий разрыв в lin-26 маскирует фенотипический эффект мутации в lin-36 [1] в классическом примере смягчающего эпистатического взаимодействия.

С другой стороны, усугубляющие мутации приводят к фенотипу, который хуже, чем кумулятивный эффект каждой отдельной мутации. Этот усугубленный фенотип указывает на два гена в компенсаторных путях. В случае одиночного мутанта параллельный путь способен компенсировать потерю нарушенного пути, однако в случае двойного мутанта действие этого компенсаторного пути также теряется, что приводит к наблюдаемому более драматичному фенотипу. Эту связь было значительно легче обнаружить, чем более тонкие смягчающие фенотипы, и она была тщательно изучена на S. cerevisiae с помощью синтетических скринингов «больной/летальный» (SSL), которые идентифицируют двойных мутантов со значительно сниженными темпами роста.

Следует отметить, что эти выводы из анализа двойных мутаций, хотя они применимы ко многим путям и мутантам, не являются универсальными. Например, гены могут действовать в противоположных направлениях в путях, так что нокаутирование обоих производит почти нормальный фенотип, в то время как каждый отдельный мутант сильно затронут (в противоположных направлениях). Хорошо изученный пример происходит во время раннего развития Drosophila, где генные продукты генов hunchback и nanos присутствуют в яйцеклетке и действуют в противоположных направлениях, направляя формирование передне-заднего паттерна. Нечто подобное часто происходит в путях передачи сигнала, где нокаутирование отрицательного регулятора пути вызывает фенотип гиперактивации, в то время как нокаутирование положительно действующего компонента производит противоположный фенотип. В линейных путях с одним «выходом», когда нокаутирующие мутации в двух противоположно действующих генах объединяются в одной особи, фенотип двойного мутанта обычно такой же, как фенотип одиночного мутанта, нормальный генный продукт которого действует ниже по течению в пути.

Методы обнаружения мутантов SSL

SGA и dSLAM

Синтетические генетические массивы (SGA) и диплоидный синтетический анализ летальности микромассивов (dSLAM) являются двумя ключевыми методами, которые использовались для идентификации синтетических больных летальных мутантов и характеристики отрицательных эпистатических отношений. Секвенирование всего генома дрожжей позволило создать библиотеку нокаутированных мутантов почти для каждого гена в геноме. Эти молекулярно штрихкодированные мутанты значительно облегчают высокопроизводительные исследования эпистаза, поскольку их можно объединять и использовать для создания необходимых двойных мутантов. Оба подхода SGA и dSLAM основаны на этих нокаутированных штаммах дрожжей, которые трансформируются/спариваются для создания гаплоидных двойных мутантов. Затем профилирование микромассивов используется для сравнения приспособленности этих одиночных и двойных мутантов. В случае SGA исследуемые двойные мутанты являются гаплоидными и собираются после спаривания с мутантным штаммом с последующими несколькими раундами отбора. Штаммы dSLAM как одиночных, так и двойных мутантов происходят из одного и того же диплоидного гетерозиготного штамма (обозначаемого как «диплоидный» в «dSLAM»). В случае анализа dSLAM приспособленность одиночных и двойных мутантов оценивается с помощью микрочипового анализа анализа конкуренции роста.

Эпистатические профили мини-решеток (E-MAP)

Для того чтобы развить более глубокое понимание генетических взаимодействий, экспериментальные подходы отходят от этой бинарной классификации фенотипов как дикого типа или синтетического летального. Подход E-MAP особенно убедителен из-за его способности выделять как смягчающие, так и усугубляющие эффекты, и эта способность отличает этот метод от других, таких как SGA и dSLAM. Более того, E-MAP не только идентифицирует оба типа взаимодействий, но и распознает градации в этих взаимодействиях и тяжесть маскированного фенотипа, представленного оценкой взаимодействия, примененной к каждой паре генов.

E-MAP используют подход SGA для анализа генетических взаимодействий с высокой пропускной способностью. Хотя метод был специально разработан для изучения эпистаза у S. cerevisiae, его можно применять и к другим модельным организмам . E-MAP собирает данные, полученные в результате систематического создания штаммов с двойными мутантами для большой четко определенной группы генов. Каждый фенотипический ответ количественно определяется путем визуализации размера колонии для определения скорости роста. Эта оценка приспособленности сравнивается с прогнозируемой приспособленностью для каждого отдельного мутанта, что приводит к оценке генетического взаимодействия. Иерархическая кластеризация этих данных для группировки генов со схожими профилями взаимодействия позволяет идентифицировать эпистатические связи между генами с известной функцией и без нее. При такой сортировке данных гены, известные своим взаимодействием, будут группироваться вместе с генами, которые демонстрируют схожую схему взаимодействий, но функция которых еще не определена. Таким образом, данные E-MAP способны помещать гены в новые функции в пределах хорошо охарактеризованных путей. Рассмотрим, например, E-MAP, представленный Коллинзом и др., который объединяет фактор удлинения транскрипции Dst1 [6] с компонентами средней области комплекса Mediator, который участвует в регуляции транскрипции . [7] Это предполагает новую роль Dst1, функционирующего совместно с Mediator.

Выбор генов, исследуемых в рамках данного E-MAP, имеет решающее значение для достижения плодотворных результатов. Особенно важно, чтобы значительная часть исследуемых генов была хорошо известна в литературе. Таким образом, эти гены могут выступать в качестве контроля для E-MAP, что позволяет с большей уверенностью анализировать данные нехарактеризованных генов. Кластеры, организованные по субклеточной локализации и общим клеточным процессам (например, клеточный цикл ), дали прибыльные результаты в S. cerevisiae. Данные исследований белок-белкового взаимодействия также могут предоставить полезную основу для выбора групп генов для данных E-MAP. Мы ожидаем, что гены, которые демонстрируют физические взаимодействия, также будут демонстрировать взаимодействия на генетическом уровне, и, таким образом, они могут служить адекватным контролем для данных E-MAP. Коллинз и др. (2007) провели сравнение оценок E-MAP и данных физического взаимодействия, полученных с помощью методов крупномасштабной аффинной очистки (AP-MS), и их данные демонстрируют, что подход E-MAP идентифицирует белок-белковые взаимодействия со специфичностью, равной специфичности традиционных методов, таких как AP-MS.

Однако высокопроизводительные методы исследования эпистатических отношений сталкиваются с трудностями, поскольку число возможных пар генов чрезвычайно велико (~20 миллионов в S. cerevisiae), а предполагаемая плотность генетических взаимодействий довольно низкая. [8] Эти трудности можно преодолеть, изучив все возможные взаимодействия в одном кластере генов, а не исследуя пары по всему геному. При правильном выборе эти функциональные кластеры содержат значительно более высокую плотность генетических взаимодействий, чем другие области генома, и, таким образом, обеспечивают более высокую скорость обнаружения, при этом резко уменьшая число пар генов, которые необходимо исследовать. [8]

Генерация мутантных штаммов: DAmP

Генерация данных для E-MAP зависит от создания тысяч штаммов с двойными мутациями; например, исследование 483 аллелей привело к созданию E-MAP с ~100 000 различных пар двойных мутаций. Однако создание библиотек мутантов основных генов представляет значительные трудности, поскольку эти мутации имеют летальный фенотип. Таким образом, исследования E-MAP основаны на штаммах с промежуточными уровнями экспрессии этих генов. Уменьшение распространенности с помощью стратегии возмущения информационной РНК (DAmP) особенно распространено для высокопроизводительной генерации мутантов, необходимых для такого рода анализа, и позволяет частично нарушать основные гены без потери жизнеспособности. [9] DAmP основан на дестабилизации транскриптов мРНК путем интеграции селективного маркера антибиотика в 3'UTR, ниже стоп-кодона (рисунок 2). мРНК с 3'-расширенными транскриптами быстро подвергаются деградации, в результате чего происходит подавление интересующего гена, при этом он остается под контролем своего нативного промотора. В случае несущественных генов могут использоваться делеционные штаммы. Маркировка мест делеции молекулярными штрихкодами, уникальными последовательностями из 20 пар оснований, позволяет идентифицировать и изучать относительные уровни приспособленности в каждом мутантном штамме.

Ссылки

  1. ^ ab Рот, Ф.; Липшиц, Х. и Эндрюс, Б. (2009). "Вопросы и ответы: Эпистаз". J. Biol . 8 (4): 35. doi : 10.1186/jbiol144 . PMC  2688915. PMID  19486505 .
  2. ^ ab Jasnos L, Korona R (апрель 2007 г.). "Эпистатическая буферизация потери приспособленности в штаммах дрожжей с двойной делецией". Nature Genetics . 39 (4): 550–554. doi :10.1038/ng1986. PMID  17322879. S2CID  19392818.
  3. ^ Фидлер, Д.; и др. (2009). «Функциональная организация сети фосфорилирования S. cerevisiae». Cell . 136 (5): 952–963. doi :10.1016/j.cell.2008.12.039. PMC 2856666 . PMID  19269370. 
  4. ^ "Lin-26 Фактор транскрипции lin-26 [Caenorhabditis elegans] - Ген - NCBI".
  5. ^ "Lin-36 Белок lin-36 [Caenorhabditis elegans] - Ген - NCBI".
  6. ^ "DST1 Dst1p [Saccharomyces cerevisiae S288C] - Ген - NCBI".
  7. ^ Коллинз и др. (2007). «Функциональное исследование белковых комплексов, участвующих в биологии хромосом дрожжей, с использованием карты генетического взаимодействия». Nature . 446 (12): 806–810. Bibcode :2007Natur.446..806C. doi :10.1038/nature05649. PMID  17314980. S2CID  4419709.
  8. ^ ab Schuldiner; et al. (2005). «Исследование функции и организации раннего секреторного пути дрожжей с помощью эпистатического профиля мини-матрицы». Cell . 123 (3): 507–519. doi : 10.1016/j.cell.2005.08.031 . PMID  16269340.
  9. ^ Шульдинер и др. (2006). «Количественный генетический анализ в Saccharomyces cerevisiae с использованием эпистатических профилей мини-матриц (E-MAP) и его применение к функциям хроматина». Методы . 40 (4): 344–352. doi :10.1016/j.ymeth.2006.07.034. PMID  17101447. S2CID  34923823.
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Epistasis_and_functional_genomics&oldid=1250514352"