ELISpot

Некоторые из перечисленных источников этой статьи могут быть ненадежными . Пожалуйста , помогите улучшить эту статью, найдя лучшие, более надежные источники. Ненадежные цитаты могут быть оспорены и удалены. ( Декабрь 2018 ) ( Узнайте, как и когда удалить это сообщение )

Иммуноферментное пятно ( ELISpot ) — это тип анализа , который фокусируется на количественном измерении частоты секреции цитокинов для одной клетки. Анализ ELISpot также является формой иммуноокрашивания , поскольку он классифицируется как метод, который использует антитела для обнаружения аналита белка, при этом слово «аналит» относится к любому биологическому или химическому веществу, которое идентифицируется или измеряется.

Анализ FluoroSpot является разновидностью анализа ELISpot. Анализ FluoroSpot использует флуоресценцию для анализа нескольких аналитов, что означает, что он может обнаружить секрецию более чем одного типа белка.

Сесил Черкински впервые описал ELISpot в 1983 году как новый способ количественной оценки продукции антиген-специфического иммуноглобулина гибридомными клетками . В 1988 году Черкински разработал точечный анализ ELISA , который количественно определял секрецию лимфокина Т -клетками . В том же году двухцветный ELISpot впервые был объединен с компьютерной визуализацией, что позволило подсчитывать и анализировать пятна. 1988 год также ознаменовался первым использованием планшетов с мембранным дном для проведения этих анализов. ^[1]

1. Покрытие антителами : в ходе метода анализа ELISpot в лунки добавляются и смываются различные вещества. Лунки находятся на лабораторной пластине с крошечными чашками/мисками, которые можно заполнить исследуемым веществом; количество лунок на пластине варьируется, но обычно составляет от 16 до 100. Первым веществом, добавляемым в лунки, являются специфические моноклональные антитела к цитокинам. Эти антитела покрывают стенки лунок для будущего связывания с цитокином. Моноклональные антитела означают, что антитело вырабатывается из одной клеточной линии и способно связываться только с одним эпитопом белка . Поликлональные антитела, с другой стороны, способны связываться с несколькими эпитопами одного и того же белка.
2. Инкубация клеток : желаемые клетки, которые наблюдаются и анализируются, добавляются в лунки. Каждая лунка может иметь наличие или отсутствие стимулов, которые активируют секрецию цитокина в клетках. Во время инкубации клеток клеткам позволяют реагировать на любые присутствующие стимулы и секретировать цитокин. Существует множество процедур и методов, которым необходимо следовать, чтобы обеспечить надлежащее обращение с клетками. Чтобы убедиться, что клетки имеют высокое качество, клетки в образцах крови следует слегка встряхивать, если они хранятся дольше 3 часов, образцы крови следует разбавить в PBS ( фосфатно-солевом буфере ) перед хранением, и образцы крови не должны содержать гранулоцитов . Любые клетки, которые были криоконсервированы и разморожены, следует оставить на час или более при температуре 37 градусов по Цельсию (типичная температура человеческого тела). ^[2] Также есть много вещей, которые следует учитывать при инкубации клеток, например, убедиться, что клетки не подвергаются резким движениям, которые могут повлиять на образование пятен, или что влажность в инкубаторе достаточно высока, чтобы избежать чрезмерного испарения и высыхания лунок. ^[3]
3. Захват цитокинов : поскольку клетки окружены специфическими моноклональными антителами к цитокинам, покрывающими стенки лунок, цитокин, секретируемый инкубированными клетками, начнет прикрепляться к антителам в определенном эпитопе.
4. Детектирующие антитела : На этом этапе лунки необходимо промыть, чтобы избавиться от клеток и любых других нежелательных веществ. Все, что должно остаться, это специфические моноклональные антитела к цитокинам и любой цитокин, который связался с антителами. Затем в лунку добавляют биотинилированные специфические антитела к цитокинам. Эти специфические антитела к цитокинам будут связываться с любым цитокином, который остался в лунке, поскольку цитокин все еще прикреплен к первому набору использованных антител. Поскольку цитокин, прикрепленный к первому набору антител, покрывающих лунки, цитокин не был смыт при промывании лунок.
5. Конъюгат стрептавидина с ферментом : Конъюгат стрептавидина с ферментом добавляется в лунки для связывания с антителами обнаружения. Целью биотинилирования цитокин-специфических антител обнаружения, добавленных в лунки на предыдущем этапе, является то, чтобы антитело могло связываться с новым конъюгатом стрептавидина с ферментом. Биотинилирование в основном создает сильное сродство между биотином на цитокин-специфическом антителе и стрептавидином на конъюгате. ^[4]
6. Добавление субстрата : субстрат добавляется в лунки и катализируется конъюгатом фермента, добавленным на предыдущем этапе. Эта реакция образует нерастворимый осадок, который образует пятна в лунках. Субстрат, который вы используете на этом этапе, будет зависеть от типа фермента, использованного на предыдущем этапе. Если используется стрептавидин-ALP (конъюгат стрептавидина и щелочной фосфатазы), то использование BCIP/NBT-plus (смесь 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата и нитросинего тетразолия хлорида) ^[5] в качестве субстрата даст более четкие пятна, которые легче анализировать. Если используется стрептавидин-HRP (конъюгат стрептавидина и пероксидазы хрена), то использование TMB (тетраметилбензидина) ^[6] в качестве субстрата даст лучшие результаты. ^[7]
7. Анализ : Образовавшиеся пятна затем можно считывать на автоматическом ридере ELISpot или подсчитывать под препаровальным микроскопом, а затем использовать для расчета частоты секреции цитокинов.

Анализ FluoroSpot очень похож на анализ ELISpot. Главное отличие заключается в том, что анализ FluoroSpot способен анализировать наличие нескольких аналитов на одном планшете с лунками, тогда как анализ ELISpot может анализировать только один аналит за раз. Анализ FluoroSpot достигает этого, используя флуоресценцию, а не ферментативную реакцию для обнаружения. Этапы анализа FluoroSpot также похожи, с некоторыми отличиями. ^[8]

1. Покрытие антителами : подобно ELISpot, цитокин-специфические моноклональные антитела захвата добавляются в планшет с лунками. Для обоих анализов планшеты обрабатываются этанолом, чтобы избежать загрязнения и искажения сбора данных. Для анализа FluoroSpot смесь различных типов антител захвата прикрепляется к лункам, чтобы обнаружить несколько типов аналитов. Чтобы получить оптимальные результаты с помощью анализа ELISpot и FluoroSpot, следует соблюдать надлежащие методы покрытия планшетов. Планшеты следует обработать этанолом, промыть, а затем покрыть антителами. Методы обработки этанолом также различаются в зависимости от типа используемых планшетов. Для планшетов MSIP и IPFL следует добавить 15 микролитров 35% этанола во все лунки. Дать этанолу постоять в лунках в течение одной минуты, а затем вылить его. Для планшетов MAIPSWU следует вместо этого добавить 50 микролитров 70% этанола во все лунки. Дайте этанолу постоять в лунках в течение двух минут, а затем вылейте его. После обработки лунок этанолом вам необходимо промыть все лунки 200 микролитрами стерильной воды. Этот процесс промывки следует повторить в общей сложности 5 раз. После обработки лунок этанолом и промывки в каждую лунку можно добавить цитокин-специфические моноклональные антитела захвата. ^[9]
2. Инкубация клеток : клетки добавляются в лунки и инкубируются в присутствии или отсутствии стимулов, влияющих на секрецию белка.
3. Захват цитокинов : белки/аналиты, которые секретируются инкубированными клетками, связываются с захватывающими антителами, прикрепленными к лункам на первом этапе.
4. Детектирующие антитела : подобно ELISpot, после промывания лунок для удаления клеток и других веществ, которые мы не хотим идентифицировать или измерять, добавляется биотинилированное детекторное антитело (оно специфично для одного типа аналита, который вы хотите количественно определить), а затем добавляются меченые метками детекторные антитела для второго и третьего типов изучаемых аналитов.
5. Конъюгаты, меченые флуорофором : вместо добавления конъюгата стрептавидин-фермент, обнаружение нескольких аналитов усиливается в FluoroSpot с использованием антитела анти-тега, меченого флуорофором, и конъюгата стрептавидин-флуорофор. На этом этапе также добавляется раствор усилителя флуоресценции для усиления сигналов, используемых позднее при анализе цветов флуоресценции в лунках. Эта флуоресценция позволяет FluoroSpot анализировать и сравнивать несколько аналитов, в отличие от ELISpot.
6. Анализ : Поскольку FluoroSpot полагается на использование флуоресценции, а не ферментативной реакции, нет необходимости в шаге, который добавляет субстрат для реакции с ферментами (как это необходимо для ELISpot). Последний шаг для анализа FluoroSpot — это анализ флуорофоров с помощью автоматического флуоресцентного ридера, который имеет отдельные фильтры для различных анализируемых флуорофоров. Эти фильтры следует выбирать для определенных длин волн флуорофоров, если вам нужны точные измерения. ^[8]

Поскольку анализ FluoroSpot идентифицирует и количественно определяет наличие нескольких аналитов, возможно, что поглощение одного аналита может повлиять на секрецию другого аналита; это называется эффектами захвата. ^[8] Эффект, который аналит оказывает на другой аналит, может быть положительным или отрицательным (выработка второго аналита может как увеличиваться, так и уменьшаться). Для противодействия эффектам захвата можно использовать костимуляцию, чтобы обойти снижение выработки аналита. ^[8] Это когда в лунки добавляется второе антитело, которое стимулирует выработку того же аналита.

Анализы ELISpot и FluoroSpot можно использовать во многих областях исследований: разработка вакцин, ^[10] рак, ^[11] аллергии, ^[12] характеристика моноцитов/макрофагов/дендритных клеток, анализ аполипопротеинов и ветеринарные исследования. С помощью ELISpot вы можете изучать антигенспецифические ответы цитокинов, специфические секретирующие клетки антител, ^[13] опухолевые антигены, ^[11] высвобождение гранзима B и перфорина Т-клетками, эффективность вакцин, ^[14] картирование эпитопов, ^[15] активность цитотоксических Т-клеток, обнаружение IL-4, IL-5 и IL-13, ^[12] вакциноиндуцированные ответы антител, антигенспецифические клетки памяти B, ^[10] и многое другое.

Более конкретно, анализ T-клеток ELISpot используется для характеристики подгрупп T-клеток. Это связано с тем, что анализ может обнаружить продукцию цитокинов IFN-y, IL-2, TNF-альфа, IL-4, IL-5 и IL-13. Первые три цитокина продуцируются клетками Th1, а последние три — клетками Th2. Измерение ответов T-клеток посредством продукции цитокинов также позволяет изучать эффективность вакцины. ^[16]

С помощью T-cell FluoroSpot вы можете контролировать лимфоциты, инфильтрирующие опухоль. Вы также можете анализировать секрецию цитокина IFN-y и гранзима B для оценки цитотоксических реакций T-клеток. Оба эти метода используются для исследования рака. ^[17]

С помощью B-cell FluoroSpot эффективность вакцины также можно наблюдать путем количественной оценки секреции IgG, IgA и IgM до и после вакцинации. Этот анализ множественных иммуноглобулинов стал возможным благодаря методу флуоресценции, используемому в FluoroSpot. ^[17]