Темный гаситель

В химии темный гаситель ( также известный как темный присоска ) — это вещество, которое поглощает энергию возбуждения от флуорофора и рассеивает ее в виде тепла ; в то время как типичный ( флуоресцентный ) гаситель повторно излучает большую часть этой энергии в виде света . ^[1] Темные гасители используются в молекулярной биологии в сочетании с флуорофорами. Когда они находятся близко друг к другу, например, в молекуле или белке , эмиссия флуорофора подавляется. Этот эффект можно использовать для изучения молекулярной геометрии и движения .

Примером его использования является TaqMan или анализ захватчиков, методы генотипирования SNP . Например, используется петля шпильки с флуорофором и гасителем у основания стебля. Немаркированный праймер ПЦР, специфичный для SNP (один из многих) с определенным 5'-хвостом связывается с исследуемой последовательностью, а полимераза Taq удлиняет последовательность, которая будет иметь определенный 5'-конец в зависимости от SNP (нечувствительный к полиморфизмам выше рассматриваемого SNP). В следующем запуске удлиняется праймер , комплементарный этому хвосту, с петлей шпильки. В следующем запуске удлинение комплементарной цепи линеаризует шпильку, разделяющую флуорофор и гаситель. Альтернативой использованию гасителей является использование FRET , где комбинация двух красителей дает сигнал. ^[2]

Темные гасители — это красители без собственной флуоресценции . До последних нескольких лет гасителями обычно были второй флуоресцентный краситель, например, флуоресцеин в качестве репортера и тетраметилродамин в качестве гасителя (зонды FAM/TAM). Однако флуоресценция гасителя может увеличить фоновый шум из-за перекрытия спектров флуоресценции гасителя и репортера. Это ограничение часто требует использования сложного анализа данных и оптических фильтров. Темные гасители предлагают решение этой проблемы, поскольку они не занимают полосу пропускания излучения. Кроме того, темные гасители позволяют осуществлять мультиплексирование (когда два или более зондов репортер-гаситель используются вместе).

Флуоресцентные красители поглощают свет, что переводит краситель в возбужденное состояние; краситель возвращается в основное состояние из возбужденного состояния, испуская свет (флуоресценция). В системе репортер – гаситель краситель безызлучательно (без света) передает энергию гасителю. Это возвращает краситель в основное состояние и создает возбужденное состояние гасителя. Затем гаситель возвращается в основное состояние посредством испускательного распада ( флуоресценции ) или безызлучательно (темновое тушение). При безызлучательном или темновом распаде энергия выделяется посредством молекулярных колебаний (тепло). При типичной концентрации образца мкМ или меньше тепло от безызлучательного распада слишком мало, чтобы повлиять на температуру раствора.

• Дабсил (диметиламиноазобензолсульфоновая кислота) поглощает в зеленом спектре и часто используется с флуоресцеином. (Дабсил имеет почти такое же поглощение, но содержит сульфонилхлорид для образования более стабильных конъюгатов вместо сукцинимидилового эфира).
• Гасители черных дыр способны гасить излучение во всем видимом спектре.
• Гасители Qxl охватывают весь видимый спектр.
• Iowa Black FQ поглощает зелено-желтую часть спектра.
• Блоки RQ Айовы Black находятся в оранжево-красной части спектра.
• IRDye QC-1 гасит красители от видимого до ближнего инфракрасного диапазона (500-900 нм). ^[3]

• Дж. Лакович, Принципы флуоресцентной спектроскопии , 2-е изд., Пленум, Нью-Йорк, 1999 .
• Йоханссон, МК; Кук, РМ (2003). «Внутримолекулярные димеры: новая стратегия разработки зондов с погашенной флуоресценцией». Chem. Eur. J . 9 (15): 3466– 3471. doi : 10.1002/chem.200304941 . PMID  12898673.

• Справочник Invitrogen: красители QSY.
• Универсальный гаситель IRDye QC-1 (500-900 нм)