Часть серии статей на тему |
Молекулярная самосборка |
---|
|
ДНК-нанотехнология — это проектирование и производство искусственных структур нуклеиновых кислот для технологических целей. В этой области нуклеиновые кислоты используются в качестве небиологических инженерных материалов для нанотехнологий, а не в качестве носителей генетической информации в живых клетках . Исследователи в этой области создали статические структуры, такие как двух- и трехмерные кристаллические решетки , нанотрубки , многогранники и произвольные формы, а также функциональные устройства, такие как молекулярные машины и ДНК-компьютеры . Область начинает использоваться в качестве инструмента для решения фундаментальных научных проблем в структурной биологии и биофизике , включая приложения в рентгеновской кристаллографии и ядерно-магнитной резонансной спектроскопии белков для определения структур. Также изучаются потенциальные приложения в молекулярной электронике и наномедицине .
Концептуальная основа ДНК-нанотехнологии была впервые заложена Надрианом Симаном в начале 1980-х годов, и область начала привлекать широкий интерес в середине 2000-х годов. Такое использование нуклеиновых кислот стало возможным благодаря их строгим правилам спаривания оснований , которые заставляют только части нитей с комплементарными последовательностями оснований связываться вместе, образуя прочные, жесткие структуры двойной спирали . Это позволяет рационально проектировать последовательности оснований , которые будут выборочно собираться, образуя сложные целевые структуры с точно контролируемыми наномасштабными характеристиками. Для создания этих структур используется несколько методов сборки, включая структуры на основе плиток, которые собираются из более мелких структур, складчатые структуры с использованием метода ДНК-оригами и динамически реконфигурируемые структуры с использованием методов смещения нитей. Название области конкретно ссылается на ДНК , но те же принципы использовались и с другими типами нуклеиновых кислот, что привело к периодическому использованию альтернативного названия нанотехнология нуклеиновых кислот .
Концептуальная основа ДНК-нанотехнологии была впервые заложена Надрианом Симаном в начале 1980-х годов. [2] Первоначальная мотивация Симана состояла в создании трехмерной решетки ДНК для ориентации других крупных молекул, что упростило бы их кристаллографическое исследование за счет устранения сложного процесса получения чистых кристаллов. Сообщается, что эта идея пришла ему в голову в конце 1980-х годов после осознания сходства между гравюрой на дереве Depth М. К. Эшера и массивом шестилучевых соединений ДНК. [3] [4] В то время было известно несколько естественных разветвленных структур ДНК, включая репликативную вилку ДНК и подвижное соединение Холлидея , но идея Симана заключалась в том, что неподвижные соединения нуклеиновых кислот могут быть созданы путем правильного проектирования последовательностей нитей для удаления симметрии в собранной молекуле, и что эти неподвижные соединения в принципе могут быть объединены в жесткие кристаллические решетки. Первая теоретическая работа, предлагающая эту схему, была опубликована в 1982 году, а первая экспериментальная демонстрация неподвижного соединения ДНК была опубликована в следующем году. [5] [6]
В 1991 году лаборатория Симана опубликовала отчет о синтезе куба из ДНК, первой синтетической трехмерной наноструктуры нуклеиновой кислоты, за которую он получил премию Фейнмана по нанотехнологиям 1995 года . За этим последовал усеченный октаэдр ДНК . Вскоре стало ясно, что эти структуры, многоугольные формы с гибкими соединениями в качестве вершин , недостаточно жесткие, чтобы образовывать протяженные трехмерные решетки. Симан разработал более жесткий структурный мотив двойного кроссовера (DX) , и в 1998 году в сотрудничестве с Эриком Уинфри опубликовал создание двумерных решеток из плиток DX. [3] [2] [7] Эти структуры на основе плиток имели то преимущество, что они обеспечивали возможность реализации ДНК-вычислений, что было продемонстрировано Уинфри и Полом Ротемундом в их статье 2004 года об алгоритмической самосборке структуры прокладки Серпинского, и за которую они разделили премию Фейнмана 2006 года в области нанотехнологий. Ключевое открытие Уинфри состояло в том, что плитки DX можно использовать как плитки Вана , что означает, что их сборка может выполнять вычисления. [2] Синтез трехмерной решетки был наконец опубликован Симаном в 2009 году, почти через тридцать лет после того, как он намеревался достичь этого. [8]
Новые возможности продолжали открываться для спроектированных структур ДНК на протяжении 2000-х годов. Первая ДНК-наномашина — мотив, который изменяет свою структуру в ответ на вход — была продемонстрирована в 1999 году Симаном. Улучшенная система, которая была первым устройством нуклеиновой кислоты, использующим смещение нити, опосредованное точкой опоры, была продемонстрирована Бернардом Юрке в 2000 году. [9] Следующим шагом вперед стало преобразование этого в механическое движение, и в 2004 и 2005 годах несколько систем ДНК-ходок были продемонстрированы группами Симана, Найлза Пирса , Эндрю Терберфилда и Чэндэ Мао. [10] Идея использования массивов ДНК для шаблонизации сборки других молекул, таких как наночастицы и белки, впервые предложенная Брюшем Робинсоном и Симаном в 1987 году, [11] была продемонстрирована в 2002 году Симаном, Килем и др. [12] и впоследствии многими другими группами.
В 2006 году Ротемунд впервые продемонстрировал метод ДНК-оригами для легкого и надежного формирования складчатых структур ДНК произвольной формы. Ротемунд задумал этот метод как концептуально промежуточный между решетками DX Зеемана, которые использовали много коротких нитей, и ДНК-октаэдром Уильяма Ши, который состоял в основном из одной очень длинной нити. ДНК-оригами Ротемунда содержит длинную нить, сворачиванию которой способствуют несколько коротких нитей. Этот метод позволил формировать гораздо более крупные структуры, чем это было возможно ранее, и которые менее технически сложны для проектирования и синтеза. [7] ДНК-оригами было главной темой журнала Nature 15 марта 2006 года. [13] За исследованиями Ротемунда, демонстрирующими двумерные структуры ДНК-оригами, последовала демонстрация Дугласом и др. сплошных трехмерных ДНК-оригами. в 2009 году [14] , в то время как лаборатории Йоргена Кьемса и Яна продемонстрировали полые трехмерные структуры, сделанные из двумерных граней. [8]
ДНК-нанотехнология изначально была встречена с некоторым скептицизмом из-за необычного небиологического использования нуклеиновых кислот в качестве материалов для строительства структур и выполнения вычислений, а также преобладания экспериментов по доказательству принципа , которые расширили возможности области, но были далеки от фактического применения. Статья Симана 1991 года о синтезе куба ДНК была отклонена журналом Science после того, как один рецензент похвалил ее оригинальность, а другой раскритиковал ее за отсутствие биологической значимости. [15] К началу 2010-х годов считалось, что область расширила свои возможности до такой степени, что приложения для фундаментальных научных исследований начали реализовываться, а практические приложения в медицине и других областях начали считаться осуществимыми. [8] [16] Область выросла с очень немногих активных лабораторий в 2001 году до по крайней мере 60 в 2010 году, что увеличило кадровый резерв и, таким образом, количество научных достижений в этой области за это десятилетие. [17]
Нанотехнология часто определяется как изучение материалов и устройств с характеристиками в масштабе ниже 100 нанометров . ДНК-нанотехнология, в частности, является примером молекулярной самосборки снизу вверх , в которой молекулярные компоненты спонтанно организуются в стабильные структуры; конкретная форма этих структур индуцируется физическими и химическими свойствами компонентов, выбранных дизайнерами. [19] В ДНК-нанотехнологии компонентными материалами являются нити нуклеиновых кислот, таких как ДНК; эти нити часто являются синтетическими и почти всегда используются вне контекста живой клетки. ДНК хорошо подходит для наномасштабного строительства, поскольку связывание между двумя нитями нуклеиновых кислот зависит от простых правил спаривания оснований , которые хорошо понятны, и образуют конкретную наномасштабную структуру двойной спирали нуклеиновой кислоты . Эти качества позволяют легко контролировать сборку структур нуклеиновых кислот с помощью дизайна нуклеиновых кислот . Это свойство отсутствует в других материалах, используемых в нанотехнологиях, включая белки , для которых проектирование белков очень сложно, и наночастицы , которые не обладают способностью к самостоятельной специфической сборке. [5]
Структура молекулы нуклеиновой кислоты состоит из последовательности нуклеотидов, отличающихся тем, какое нуклеиновое основание они содержат. В ДНК присутствуют четыре основания: аденин (A), цитозин (C), гуанин (G) и тимин (T). Нуклеиновые кислоты обладают свойством, что две молекулы будут связываться друг с другом, образуя двойную спираль, только если две последовательности комплементарны , что означает, что они образуют соответствующие последовательности пар оснований, при этом A связывается только с T, а C — только с G. [5] [20] Поскольку образование правильно соответствующих пар оснований энергетически выгодно , ожидается, что нити нуклеиновой кислоты в большинстве случаев будут связываться друг с другом в конформации, которая максимизирует количество правильно спаренных оснований. Таким образом, последовательности оснований в системе нитей определяют схему связывания и общую структуру легко контролируемым образом. В ДНК-нанотехнологии последовательности оснований нитей рационально проектируются исследователями таким образом, чтобы взаимодействия пар оснований приводили к сборке нитей в желаемой конформации. [3] [5] Хотя ДНК является доминирующим используемым материалом, также были созданы структуры, включающие другие нуклеиновые кислоты, такие как РНК и пептидонуклеиновая кислота (ПНК). [21] [22]
ДНК-нанотехнологию иногда делят на два пересекающихся подполя: структурная ДНК-нанотехнология и динамическая ДНК-нанотехнология. Структурная ДНК-нанотехнология, иногда сокращенно SDN, фокусируется на синтезе и характеристике комплексов нуклеиновых кислот и материалов, которые собираются в статическое, равновесное конечное состояние. С другой стороны, динамическая ДНК-нанотехнология фокусируется на комплексах с полезным неравновесным поведением, таким как способность перестраиваться на основе химического или физического стимула. Некоторые комплексы, такие как наномеханические устройства нуклеиновых кислот, сочетают в себе черты как структурных, так и динамических подполей. [23] [24]
Комплексы, построенные в структурной ДНК-нанотехнологии, используют топологически разветвленные структуры нуклеиновых кислот, содержащие соединения. (В отличие от этого, большая часть биологической ДНК существует в виде неразветвленной двойной спирали .) Одной из простейших разветвленных структур является четырехплечевое соединение, которое состоит из четырех отдельных цепей ДНК, части которых комплементарны в определенном шаблоне. В отличие от естественных соединений Холлидея , каждое плечо в искусственном неподвижном четырехплечевом соединении имеет различную последовательность оснований , в результате чего точка соединения фиксируется в определенном положении. Несколько соединений могут быть объединены в одном комплексе, например, в широко используемом структурном мотиве двойного кроссовера (DX) , который содержит два параллельных двойных спиральных домена с отдельными цепями, пересекающимися между доменами в двух точках кроссовера. Каждая точка кроссовера топологически является четырехплечевым соединением, но ограничено одной ориентацией, в отличие от гибкого одиночного четырехплечевого соединения, что обеспечивает жесткость, которая делает мотив DX подходящим в качестве структурного строительного блока для более крупных комплексов ДНК. [3] [5]
Динамическая ДНК-нанотехнология использует механизм, называемый смещением нити, опосредованным точкой опоры , чтобы позволить комплексам нуклеиновых кислот перестраиваться в ответ на добавление новой нити нуклеиновой кислоты. В этой реакции входящая нить связывается с одноцепочечной областью точки опоры двухцепочечного комплекса, а затем смещает одну из нитей, связанных в исходном комплексе, посредством процесса миграции ветвей . Общий эффект заключается в том, что одна из нитей в комплексе заменяется другой. [23] Кроме того, реконфигурируемые структуры и устройства могут быть созданы с использованием функциональных нуклеиновых кислот, таких как дезоксирибозимы и рибозимы , которые могут выполнять химические реакции, и аптамеры , которые могут связываться со специфическими белками или малыми молекулами. [25]
Структурная ДНК-нанотехнология, иногда сокращенно SDN, фокусируется на синтезе и характеристике комплексов нуклеиновых кислот и материалов, где сборка имеет статическую, равновесную конечную точку. Двойная спираль нуклеиновой кислоты имеет надежную, определенную трехмерную геометрию, которая позволяет моделировать, [26] предсказывать и проектировать структуры более сложных комплексов нуклеиновых кислот. Было создано много таких структур, включая двух- и трехмерные структуры, а также периодические, апериодические и дискретные структуры. [24]
Небольшие комплексы нуклеиновых кислот могут быть снабжены липкими концами и объединены в более крупные двумерные периодические решетки, содержащие определенный мозаичный рисунок отдельных молекулярных плиток. [24] Самый ранний пример этого использовал комплексы двойного кроссинговера (DX) в качестве основных плиток, каждая из которых содержала четыре липких конца, разработанных с последовательностями, которые заставляли единицы DX объединяться в периодические двумерные плоские листы, которые по сути являются жесткими двумерными кристаллами ДНК. [30] [31] Двумерные массивы были сделаны также из других мотивов, включая ромбовидную решетку Холлидея [32] и различные массивы на основе DX, использующие схему двойной когезии. [33] [34] На двух верхних изображениях справа показаны примеры периодических решеток на основе плиток.
Двумерные массивы могут быть созданы для демонстрации апериодических структур, сборка которых реализует определенный алгоритм, демонстрируя одну из форм ДНК-вычислений. [17] Плитки DX могут иметь свои липкие конечные последовательности, выбранные так, чтобы они действовали как плитки Вана , что позволяет им выполнять вычисления. Был продемонстрирован массив DX, сборка которого кодирует операцию XOR ; это позволяет массиву ДНК реализовать клеточный автомат , который генерирует фрактал , известный как сальник Серпинского . Третье изображение справа показывает этот тип массива. [29] Другая система имеет функцию двоичного счетчика , отображая представление увеличивающихся двоичных чисел по мере его роста. Эти результаты показывают, что вычисления могут быть включены в сборку массивов ДНК. [35]
Массивы DX были созданы для формирования полых нанотрубок диаметром 4–20 нм , по сути двумерных решеток, которые изгибаются сами по себе. [36] Эти ДНК-нанотрубки по размеру и форме несколько похожи на углеродные нанотрубки , и хотя у них отсутствует электропроводность углеродных нанотрубок, ДНК-нанотрубки легче модифицировать и соединять с другими структурами. Одна из многих схем построения ДНК-нанотрубок использует решетку изогнутых плиток DX, которая закручивается вокруг себя и закрывается в трубку. [37] В альтернативном методе, который позволяет задавать окружность простым модульным способом с использованием одноцепочечных плиток, жесткость трубки является возникающим свойством . [38]
Формирование трехмерных решеток ДНК было самой ранней целью ДНК-нанотехнологии, но это оказалось одной из самых сложных для реализации. Успех с использованием мотива, основанного на концепции тенсегрити , баланса между силами растяжения и сжатия, был наконец зарегистрирован в 2009 году. [17] [39]
Исследователи синтезировали множество трехмерных комплексов ДНК, каждый из которых имеет связность многогранника , например, куба или октаэдра , что означает, что дуплексы ДНК отслеживают края многогранника с ДНК-соединением в каждой вершине. [6] Самые ранние демонстрации ДНК-многогранников были очень трудоемкими, требуя множественных лигирований и этапов твердофазного синтеза для создания катенированных многогранников. [40] Последующие работы дали многогранники, синтез которых был намного проще. К ним относятся ДНК-октаэдр, сделанный из длинной одиночной нити, предназначенной для складывания в правильную конформацию, [41] и тетраэдр, который можно получить из четырех нитей ДНК за один шаг, изображенный в верхней части этой статьи. [1]
Наноструктуры произвольных, нерегулярных форм обычно изготавливаются с использованием метода ДНК-оригами . Эти структуры состоят из длинной, естественной вирусной нити в качестве «леса», который складывается в желаемую форму с помощью вычислительно спроектированных коротких «скрепочных» нитей. Этот метод имеет преимущества в том, что его легко проектировать, так как последовательность оснований предопределена последовательностью нити леска, и он не требует высокой чистоты нити и точной стехиометрии , как большинство других методов ДНК-нанотехнологии. ДНК-оригами впервые было продемонстрировано для двумерных фигур, таких как смайлик , грубая карта Западного полушария и картина Моны Лизы. [6] [13] [42] Твердые трехмерные структуры могут быть созданы с использованием параллельных спиралей ДНК, расположенных в виде сот, [14] а структуры с двумерными гранями могут быть сложены в полую общую трехмерную форму, похожую на картонную коробку. Их можно запрограммировать на открытие и обнаружение или высвобождение молекулярного груза в ответ на стимул, что делает их потенциально полезными в качестве программируемых молекулярных клеток . [43] [44]
Структуры нуклеиновых кислот могут быть созданы для включения молекул, отличных от нуклеиновых кислот, иногда называемых гетероэлементами, включая белки, металлические наночастицы, квантовые точки , амины , [45] и фуллерены . Это позволяет создавать материалы и устройства с диапазоном функциональностей, намного большим, чем это возможно с одними нуклеиновыми кислотами. Цель состоит в том, чтобы использовать самосборку структур нуклеиновых кислот для шаблонизации сборки наночастиц, размещенных на них, контролируя их положение и в некоторых случаях ориентацию. [6] [46] Многие из этих схем используют схему ковалентного присоединения, используя олигонуклеотиды с амидными или тиольными функциональными группами в качестве химической ручки для связывания гетероэлементов. Эта схема ковалентного связывания использовалась для размещения золотых наночастиц на основе массива DX, [47] и для размещения молекул белка стрептавидина в определенных узорах на массиве DX. [48] Нековалентная схема размещения с использованием полиамидов Dervan на массиве DX была использована для размещения белков стрептавидина в определенном шаблоне на массиве DX. [49] Углеродные нанотрубки были размещены на массивах ДНК в шаблоне, позволяющем сборке действовать как молекулярное электронное устройство, полевой транзистор на основе углеродных нанотрубок . [50] Кроме того, существуют методы металлизации нуклеиновых кислот, в которых нуклеиновая кислота заменяется металлом, который принимает общую форму исходной структуры нуклеиновой кислоты, [51] и схемы использования наноструктур нуклеиновых кислот в качестве литографических масок, переносящих их шаблон на твердую поверхность. [52]
Динамическая ДНК-нанотехнология фокусируется на формировании систем нуклеиновых кислот с разработанными динамическими функциями, связанными с их общими структурами, такими как вычисления и механическое движение. Существует некоторое совпадение между структурной и динамической ДНК-нанотехнологией, поскольку структуры могут быть сформированы посредством отжига, а затем динамически реконфигурированы или могут быть изначально сформированы динамически. [6] [10]
Были созданы комплексы ДНК, которые изменяют свою конформацию при некотором стимуле, что делает их одной из форм наноробототехники . Эти структуры изначально формируются таким же образом, как и статические структуры, созданные в структурной ДНК-нанотехнологии, но спроектированы таким образом, что динамическая реконфигурация возможна после первоначальной сборки. [23] [10] Самое раннее такое устройство использовало переход между формами B-ДНК и Z-ДНК для реагирования на изменение условий буфера путем совершения скручивающего движения. [53] Эта зависимость от условий буфера заставляла все устройства менять состояние одновременно. Последующие системы могли изменять состояние на основе наличия контрольных нитей, что позволяло нескольким устройствам независимо работать в растворе. Некоторые примеры таких систем - конструкция "молекулярного пинцета", которая имеет открытое и закрытое состояние, [54] устройство, которое может переключаться из конформации паранемического кроссовера (PX) в конформацию (JX2) с двумя непересекающимися сопоставлениями остова ДНК, совершая вращательное движение в процессе, [55] и двумерный массив, который может динамически расширяться и сжиматься в ответ на контрольные нити. [56] Также были созданы структуры, которые динамически открываются или закрываются, потенциально действуя как молекулярная клетка для высвобождения или раскрытия функционального груза при открытии. [43] [57] [58] В другом примере наноструктура ДНК-оригами была связана с РНК-полимеразой T7 и, таким образом, могла работать как двигатель, работающий на химической энергии, который может быть связан с пассивным последователем, который он затем приводит в движение. [59]
ДНК-ходоки — это класс наномашин нуклеиновых кислот, которые демонстрируют направленное движение по линейной дорожке. Было продемонстрировано большое количество схем. [10] Одна из стратегий заключается в управлении движением ходока по дорожке с помощью контрольных нитей, которые необходимо вручную добавлять в последовательности. [60] [61] Также возможно контролировать отдельные шаги ДНК-ходока путем облучения светом с разными длинами волн. [62] Другой подход заключается в использовании рестрикционных ферментов или дезоксирибозимов для расщепления нитей и приведения ходока в движение, что имеет преимущество автономного движения. [63] [64] Более поздняя система могла ходить по двумерной поверхности, а не по линейной дорожке, и продемонстрировала способность избирательно подбирать и перемещать молекулярный груз. [65] В 2018 году было показано, что связанная ДНК, которая использует транскрипцию катящегося кольца прикрепленной РНК-полимеразой T7, ходит по ДНК-пути, направляемая сгенерированной РНК-нитью. [66] Кроме того, был продемонстрирован линейный шагоход, который выполняет синтез на основе ДНК по мере продвижения шагохода по дорожке, что позволяет осуществлять автономный многоступенчатый химический синтез, направляемый шагоходом. [67] Функция синтетических шагоходов ДНК аналогична функции белков динеина и кинезина. [68]
Каскады реакций смещения нитей могут использоваться как для вычислительных, так и для структурных целей. Отдельная реакция смещения нитей включает в себя обнаружение новой последовательности в ответ на присутствие некоторой инициирующей нити. Многие такие реакции могут быть связаны в каскад , где вновь обнаруженная выходная последовательность одной реакции может инициировать другую реакцию смещения нитей в другом месте. Это, в свою очередь, позволяет строить химические реакционные сети со многими компонентами, демонстрируя сложные вычислительные и информационные возможности обработки. Эти каскады делаются энергетически выгодными за счет образования новых пар оснований и прироста энтропии от реакций разборки. Каскады смещения нитей допускают изотермическую работу сборки или вычислительного процесса, в отличие от традиционного требования сборки нуклеиновых кислот для этапа термического отжига, где температура повышается, а затем медленно понижается, чтобы гарантировать правильное формирование желаемой структуры. Они также могут поддерживать каталитическую функцию видов инициатора, где менее одного эквивалента инициатора может привести к завершению реакции. [23] [69]
Комплексы смещения нитей могут быть использованы для создания молекулярных логических вентилей , способных выполнять сложные вычисления. [70] В отличие от традиционных электронных компьютеров, которые используют электрический ток в качестве входов и выходов, молекулярные компьютеры используют концентрации определенных химических видов в качестве сигналов. В случае цепей смещения нитей нуклеиновых кислот сигналом является наличие нитей нуклеиновых кислот, которые высвобождаются или потребляются посредством событий связывания и разъединения с другими нитями в комплексах смещения. Этот подход использовался для создания логических вентилей, таких как вентили И, ИЛИ и НЕ. [71] Совсем недавно была продемонстрирована четырехбитная схема, которая может вычислять квадратный корень целых чисел 0–15, используя систему вентилей, содержащую 130 нитей ДНК. [72]
Другое применение каскадов смещения нитей — создание динамически собранных структур. Они используют шпильковую структуру для реагентов, так что когда входная нить связывается, вновь выявленная последовательность находится на той же молекуле, а не разбирается. Это позволяет добавлять новые открытые шпильки к растущему комплексу. Этот подход использовался для создания простых структур, таких как трех- и четырехлучевые соединения и дендримеры . [69]
ДНК-нанотехнология обеспечивает один из немногих способов формирования спроектированных сложных структур с точным контролем над наномасштабными характеристиками. Область начинает видеть применение для решения фундаментальных научных проблем в структурной биологии и биофизике . Самое раннее такое применение, предусмотренное для области, и одно все еще в разработке, - это кристаллография , где молекулы, которые трудно кристаллизовать в изоляции, могут быть расположены в трехмерной решетке нуклеиновой кислоты, что позволяет определять их структуру. Другое применение - использование стержней ДНК-оригами для замены жидких кристаллов в экспериментах по остаточному дипольному сопряжению в белковой ЯМР-спектроскопии ; использование ДНК-оригами выгодно, поскольку, в отличие от жидких кристаллов, они устойчивы к детергентам, необходимым для суспендирования мембранных белков в растворе. ДНК-ходоки использовались в качестве наномасштабных сборочных линий для перемещения наночастиц и прямого химического синтеза . Кроме того, структуры ДНК-оригами помогли в биофизических исследованиях функции ферментов и сворачивания белков . [24] [8]
ДНК-нанотехнология движется к потенциальным реальным приложениям. Способность массивов нуклеиновых кислот организовывать другие молекулы указывает на ее потенциальные применения в молекулярной электронике. Сборка структуры нуклеиновой кислоты может быть использована для шаблона сборки молекулярных электронных элементов, таких как молекулярные провода , предоставляя метод для нанометрового контроля размещения и общей архитектуры устройства, аналогичного молекулярному макету . [24] [6] ДНК-нанотехнологию сравнивают с концепцией программируемой материи из-за связи вычислений со свойствами ее материала. [73]
В исследовании, проведенном группой ученых из центров iNANO и CDNA в Университете Орхуса , исследователи смогли сконструировать небольшую многопереключаемую 3D ДНК-коробку-оригами. Предложенная наночастица была охарактеризована с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET). Было показано, что сконструированная коробка имеет уникальный механизм повторного закрытия, который позволяет ей многократно открываться и закрываться в ответ на уникальный набор ключей ДНК или РНК. Авторы предположили, что это «устройство ДНК может потенциально использоваться для широкого спектра приложений, таких как управление функцией отдельных молекул, контролируемая доставка лекарств и молекулярные вычисления». [74]
Существуют потенциальные приложения для ДНК-нанотехнологий в наномедицине, использующие ее способность выполнять вычисления в биосовместимом формате для создания «умных лекарств» для целевой доставки лекарств , а также для диагностических приложений. Одна из таких исследуемых систем использует полый ДНК-бокс, содержащий белки, которые вызывают апоптоз или гибель клеток, который открывается только при приближении к раковой клетке . [8] [75] Кроме того, был интерес к экспрессии этих искусственных структур в сконструированных живых бактериальных клетках, скорее всего, с использованием транскрибированной РНК для сборки, хотя неизвестно, способны ли эти сложные структуры эффективно складываться или собираться в цитоплазме клетки . В случае успеха это может обеспечить направленную эволюцию наноструктур нуклеиновых кислот. [6] Ученые из Оксфордского университета сообщили о самосборке четырех коротких нитей синтетической ДНК в клетку, которая может проникать в клетки и выживать в течение как минимум 48 часов. Было обнаружено, что тетраэдры ДНК с флуоресцентной меткой оставались нетронутыми в культивируемых в лаборатории клетках почек человека, несмотря на атаку клеточных ферментов через два дня. Этот эксперимент продемонстрировал потенциал доставки лекарств внутрь живых клеток с использованием «клетки» ДНК. [76] [77] Тетраэдр ДНК использовался для доставки РНК-интерференции (РНКi) в мышиной модели, сообщила группа исследователей из Массачусетского технологического института . Доставка интерферирующей РНК для лечения показала определенный успех с использованием полимера или липида , но существуют ограничения безопасности и неточное нацеливание, в дополнение к короткому сроку хранения в кровотоке. Наноструктура ДНК, созданная командой, состоит из шести нитей ДНК, образующих тетраэдр, с одной нитью РНК, прикрепленной к каждому из шести ребер. Тетраэдр дополнительно оснащен целевым белком, тремя молекулами фолиевой кислоты , которые направляют наночастицы ДНК к обильным рецепторам фолиевой кислоты, обнаруженным в некоторых опухолях. Результат показал, что экспрессия гена, на который нацелена РНК-интерференция, люцифераза , снизилась более чем наполовину. Это исследование показывает перспективность использования ДНК-нанотехнологии в качестве эффективного инструмента для доставки лечения с использованием новой технологии РНК-интерференции. [78] [79] Тетраэдр ДНК также использовался в попытке преодолеть явление множественной лекарственной устойчивости . Доксорубицин(DOX) был конъюгирован с тетраэдром и загружен в клетки рака молочной железы MCF-7, которые содержали насос для оттока препарата P-гликопротеина . Результаты эксперимента показали, что DOX не откачивался, и был достигнут апоптоз раковых клеток. Тетраэдр без DOX был загружен в клетки для проверки его биосовместимости, и структура не показала никакой цитотоксичности. [80] ДНК-тетраэдр также использовался в качестве штрих-кода для профилирования субклеточной экспрессии и распределения белков в клетках в диагностических целях. Тетраэдрально-наноструктурированный показал усиленный сигнал из-за более высокой эффективности и стабильности маркировки. [81]
Применение ДНК-нанотехнологий в наномедицине также сосредоточено на имитации структуры и функции природных мембранных белков с помощью разработанных ДНК-наноструктур. В 2012 году Лангекер и др. [82] представили структуру ДНК-оригами в форме пор, которая может самостоятельно встраиваться в липидные мембраны посредством гидрофобных модификаций холестерина и вызывать ионные токи через мембрану. За этой первой демонстрацией синтетического ионного канала ДНК последовало множество конструкций, индуцирующих поры , начиная от одиночного дуплекса ДНК [83] до небольших структур на основе плиток [84] [85] [86] [87] [88] и больших трансмембранных поринов ДНК-оригами [89] Подобно природным ионным каналам белков , этот ансамбль синтетических аналогов, созданных ДНК, тем самым охватывает несколько порядков величины проводимости. Изучение вставленного в мембрану одиночного дуплекса ДНК показало, что ток также должен протекать по интерфейсу ДНК-липид, поскольку в конструкции отсутствует просвет центрального канала, который позволяет ионам проходить через липидный бислой . Это указывает на то, что липидная пора, индуцированная ДНК, имеет тороидальную форму, а не цилиндрическую, поскольку липидные головные группы переориентируются в сторону вставленной в мембрану части ДНК. [83] Затем исследователи из Кембриджского университета и Иллинойсского университета в Урбане-Шампейне продемонстрировали, что такая тороидальная пора, индуцированная ДНК, может способствовать быстрому липидному флип-флопу между листками липидного бислоя. Используя этот эффект, они разработали синтетический фермент, построенный на основе ДНК , который переворачивает липиды в биологических мембранах на порядки быстрее, чем природные белки, называемые скрамблазами . [90] Эта разработка подчеркивает потенциал синтетических ДНК-наноструктур для персонализированных лекарств и терапевтических средств.
Наноструктуры ДНК должны быть рационально спроектированы так, чтобы отдельные нити нуклеиновых кислот собирались в желаемые структуры. Этот процесс обычно начинается с спецификации желаемой целевой структуры или функции. Затем определяется общая вторичная структура целевого комплекса, определяющая расположение нитей нуклеиновых кислот в структуре и то, какие части этих нитей должны быть связаны друг с другом. Последним шагом является проектирование первичной структуры , которое представляет собой спецификацию фактических последовательностей оснований каждой нити нуклеиновых кислот. [36] [91]
Первым шагом в проектировании наноструктуры нуклеиновой кислоты является решение о том, как данная структура должна быть представлена определенным расположением нитей нуклеиновой кислоты. Этот шаг проектирования определяет вторичную структуру или положения пар оснований, которые удерживают отдельные нити вместе в желаемой форме. [36] Было продемонстрировано несколько подходов:
После того, как любой из вышеперечисленных подходов использован для проектирования вторичной структуры целевого комплекса, должна быть разработана фактическая последовательность нуклеотидов, которая сформируется в желаемую структуру. Проектирование нуклеиновых кислот представляет собой процесс назначения определенной последовательности оснований нуклеиновых кислот каждой из составляющих цепей структуры, чтобы они ассоциировались в желаемую конформацию. Большинство методов имеют целью проектирование последовательностей таким образом, чтобы целевая структура имела самую низкую энергию и, таким образом, была наиболее термодинамически выгодной, в то время как неправильно собранные структуры имели более высокую энергию и, таким образом, были невыгодны. Это делается либо с помощью простых, быстрых эвристических методов, таких как минимизация симметрии последовательности, либо с помощью полной термодинамической модели ближайшего соседа , которая является более точной, но более медленной и более вычислительно интенсивной. Геометрические модели используются для изучения третичной структуры наноструктур и для обеспечения того, чтобы комплексы не были чрезмерно напряжены . [91] [93]
Дизайн нуклеиновых кислот имеет схожие цели с дизайном белков . В обоих случаях последовательность мономеров проектируется так, чтобы благоприятствовать желаемой целевой структуре и не благоприятствовать другим структурам. Дизайн нуклеиновых кислот имеет то преимущество, что он намного проще в вычислительном отношении, чем дизайн белков, поскольку простых правил спаривания оснований достаточно для прогнозирования энергетической благоприятности структуры, а подробная информация об общей трехмерной складке структуры не требуется. Это позволяет использовать простые эвристические методы, которые дают экспериментально надежные конструкции. Структуры нуклеиновых кислот менее универсальны, чем белки, в своей функции из-за повышенной способности белков складываться в сложные структуры и ограниченного химического разнообразия четырех нуклеотидов по сравнению с двадцатью протеиногенными аминокислотами . [93]
Последовательности цепей ДНК, составляющие целевую структуру, проектируются вычислительным путем с использованием программного обеспечения для молекулярного моделирования и термодинамического моделирования . [91] [93] Затем сами нуклеиновые кислоты синтезируются с использованием стандартных методов синтеза олигонуклеотидов , обычно автоматизированных в синтезаторе олигонуклеотидов , а цепи пользовательских последовательностей доступны в продаже. [94] При необходимости цепи можно очистить с помощью денатурирующего гель-электрофореза , [95] а точные концентрации определить с помощью любого из нескольких методов количественного определения нуклеиновых кислот с использованием ультрафиолетовой абсорбционной спектроскопии . [96]
Полностью сформированные целевые структуры можно проверить с помощью нативного гель-электрофореза, который дает информацию о размере и форме комплексов нуклеиновых кислот. Анализ сдвига электрофоретической подвижности может оценить, включает ли структура все желаемые нити. [97] Флуоресцентная маркировка и резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) иногда используются для характеристики структуры комплексов. [98]
Структуры нуклеиновых кислот могут быть напрямую визуализированы с помощью атомно-силовой микроскопии , которая хорошо подходит для расширенных двумерных структур, но менее полезна для дискретных трехмерных структур из-за взаимодействия кончика микроскопа с хрупкой структурой нуклеиновой кислоты; в этом случае часто используются просвечивающая электронная микроскопия и криоэлектронная микроскопия . Расширенные трехмерные решетки анализируются с помощью рентгеновской кристаллографии . [99] [100]
Общий:
Конкретные подполя: