Инженерия цитохрома P450

В этой статье рассматривается белковая инженерия [1] ферментов цитохрома (CYP) P450 . P450 участвуют в ряде биохимических катаболических и анаболических процессов . [2] Природные P450 могут выполнять несколько различных типов химических реакций, включая гидроксилирование , N,O,S-деалкилирование , эпоксидирование , сульфоксидирование, арильно-арильные связи , сужение и расширение колец , окислительную циклизацию, окисление спиртов/альдегидов, десатурацию , окисление азота, декарбоксилирование , нитрование , а также окислительное и восстановительное дегалогенирование . [2] [3] Инженерные усилия часто направлены на 1) улучшение стабильности, 2) улучшение активности, 3) улучшение субстратного охвата, 4) обеспечение способности катализировать неестественные реакции. [4] [5] Инженерия P450 является новой областью в областях химической биологии и синтетической органической химии (хемоферментативной).

Подходы к разработке ферментов цитохрома P450

Рациональный

Рациональная ферментная инженерия характеризуется созданием специфических мутаций аминокислот на основе механистической или структурной информации. В то время как ферменты P450 механистически хорошо изучены, мутации на основе структурной информации часто ограничены трудностями кристаллизации . [4] [5] Хотя, когда это возможно, высокая степень гибкости и пластичности активного центра, присутствующая в P450, делает кристаллические структуры в значительной степени устаревшими для рационального проектирования. [5] Другая проблема возникает при попытке расширить область применения субстрата. Это часто достигается путем увеличения размера активного центра P450 , что, в свою очередь, может привести к множественным ориентациям стыковки субстрата , что приводит к плохой регио-/стереоселективности. [5]

Направленная эволюция

Направленная эволюция — это стратегия ферментной инженерии, разработанная для имитации естественного отбора в лабораторных условиях. [2] [4] [5] Из-за сложности реализации стратегий рационального проектирования направленная эволюция стала стратегией выбора для инженерии P450. Здесь мутации могут быть введены либо полурационально, либо случайным образом с помощью мутагенеза с насыщением сайтов . Полученный мутант P450 (обычно библиотека мутантов) затем проверяется на желаемую активность. [5] [6] [7] Мутанты, демонстрирующие улучшенные свойства, направляются на последующие раунды мутагенеза, повторяя этот цикл до тех пор, пока желаемая функция не будет адекватно выполнена.

Примеры проектирования P450

П450 БМ3

P450 BM3 (также известный как CYP102A1) — это фермент цитохрома P450, выделенный из Bacillus megaterium . [2] [4] [5] [6] [8] BM3 был широко изучен в контексте ферментной инженерии из-за его растворимости, податливых бактериальных изоформ и самодостаточной системы транспорта электронов, а также из-за его синтетической полезности. [8] Инженерные исследования показали, что мутанты BM3 могут 1) быть наделены новыми и дифференцированными субстратными областями 2) проявлять регио-/стереоселективность на новых субстратах и ​​3) быть сконструированы так, чтобы быть высокоселективными и активными по отношению к новым субстратам. [5] [6] [8] Варианты BM3 были особенно полезны для производства ароматизаторов , вкусовых добавок , феромонов и фармацевтических препаратов . [8] Артемизиновая кислота (используемая в производстве фармацевтического натурального продукта артемизинина ) была получена с использованием варианта BM3, ответственного за эпоксидирование двух алкенов, присутствующих в аморфа-4,11-диене. [8] [9] Окисление валенсена в нооткатон ( ценный грейпфрутовый ароматизатор) было достигнуто с использованием мутанта F87T и I263A (рисунок 1). [8]

Рисунок 1. Окисление (+)-валенсена с использованием мутанта P450 BM3 F87T I263A

Недавно Ван и др. сообщили о варианте BM3, способном выполнять циклопропанирование стиренилолефина . [6] Поскольку нативный BM3 демонстрирует слабую активность циклопропанирования, были предприняты усилия по ферментной инженерии. По своей сути, P450 являются гем-тиолатными ферментами, которые используют молекулярный кислород (O 2 ) и NAD(P)H для выполнения реакций оксигенации. [10] Таким образом, BM3 предпочитает выполнять эпоксидирование, а не реакции циклопропанирования в присутствии олефинов. [6] Реакция между этилдиазоацетатом (EDA) и 1 была выбрана в качестве модельной реакции из-за известной трудности эпоксидирования олефинов с дефицитом электронов с использованием катализа переходными металлами (рисунок 2). [6] Эта реакция генерирует соединение 2 , которое можно легко преобразовать в левомилнаципран (Fetzima), фармацевтическое средство, используемое для лечения клинической депрессии . [6] Для начала были получены мутанты, в которых аксиальный координирующий остаток цистеина в каталитическом центре был заменен аминокислотами серином, аланином, метионином, гистидином и тирозином. Мутант T268A-axH, имеющий аксиальный лиганд гистидина, катализировал реакцию между EDA и 1 с выходом 81% с диастереоселективностью 6:94 и энантиоселективностью 42%. [6] Затем были проведены последующие раунды мутагенеза с насыщением сайта , в результате чего был получен вариант, названный BM3-Hstar (содержащий мутации T268A-axH, L437W, V78M и L181V), который мог катализировать модельную реакцию с выходом более 92%, энантиоселективностью 92% и диастереоселективностью 2:98. [6] В качестве дополнительного преимущества BM3-Hstar также был способен выполнять желаемую реакцию циклопропанирования в присутствии атмосферного кислорода (O2) (единственный известный вариант BM3, способный на это). [6]

Рисунок 2. Реакция между 1 и этилдиазоацетатом (ЭДА), катализируемая BM3-Hstar

CYP125

Помимо их синтетической полезности, ферменты P450 также были разработаны для лучшего понимания их биохимии. [10] На основе предложенного каталитического цикла аксиально лигированный тиолатный фрагмент (цистеин) отдает электронную плотность металлическому центру, способствуя протонированию промежуточного аниона железа-пероксо ( − OO-Fe 3+ ), который при потере воды генерирует реактивные по связи CH виды железа-оксо (O=Fe 4+ ). [2] [5] [8] [10] Альтернативно, если анион железа-пероксо остается непротонированным, этот реактивный вид может опосредовать разрыв связи CC в альдегидсодержащих субстратах (деформилирование). [10] Для лучшего понимания промежуточной дихотомии между анионом железа-пероксо и железо-оксо видами, CYP125 (который отвечает за различные метаболические процессы, включая деградацию холестерина) был сконструирован для замены аксиального лигированного остатка цистеина селеноцистеином (SeCYP125). В свою очередь, было отмечено, что SeCYP125 способствует образованию окисленных продуктов по сравнению с деформилированными продуктами при реакции с холестерин-26-альдегидом, указывая на то, что повышенное донорство электронов селеноцистеином по сравнению с цистеином приводит к более высокой доле железа-оксо по сравнению с железо-пероксо анионом (рисунок 3). [10]

Рисунок 3. Сравнение эффектов аксиального лиганда на анион пероксо-железа в каталитическом цикле CYP125

Ir(Me)-CYP119-Макс

В 2016 году в работе, опубликованной Dydio et al., сообщалось об искусственном металлоферменте, способном катализировать внутри-/межмолекулярные карбеновые CH-вставки в активированные/неактивированные CH-связи с кинетикой, подобной кинетике нативного фермента (рисунок 4). Описанный катализатор был разработан путем переключения кофактора железо-протопорфирина в термостабильном ферменте P450 CYP119A1 на кофактор иридий-метил -протопорфирин (Ir(Me)-PIX) с последующей направленной эволюцией. Впоследствии был получен CYP119-Max, четверной мутант (C317G, T213G, L69V, V254L). Энантиомерные избытки (ee) до ±98% были получены при фиксированной загрузке катализатора 0,17 мол. %. CYP119-Max также может подвергаться реакциям межмолекулярной вставки, хотя и с умеренным ee (68%). Чтобы продемонстрировать применимость CYP119-Max в производстве тонких химикатов, реакция в масштабе 200 мМ дала этил-2,3-дигидробензофуран-3-карбоксилат с выходом 44%, с числом оборотов 35 000 (TON) и 93% ee. [7]

Рисунок 4. Реакции, катализируемые мутантами металлофермента CYP119 Ir(Me)-PIX-CYP119

Ссылки

  1. ^ Бранниган, Джеймс; Уилкинсон, Энтони (декабрь 2002 г.). «Белковая инженерия 20 лет спустя». Nature Reviews Molecular Cell Biology . 3 (12): 964–70. doi :10.1038/nrm975. PMID  12461562. S2CID  1591624.
  2. ^ abcde Макинтош, Джон; Фарвелл, Кристофер; Арнольд, Фрэнсис (20 марта 2014 г.). «Расширение пространства каталитических реакций P450 посредством эволюции и инженерии». Current Opinion in Chemical Biology . 19 : 126–134. doi :10.1016/j.cbpa.2014.02.001. PMC 4008644. PMID  24658056 . 
  3. ^ Манро, Эндрю; Гирван, Хейзел; Маклин, Кирсти (15 декабря 2006 г.). «Вариации на основе новых механизмов гема, окислительно-восстановительные партнеры и каталитические функции в суперсемействе цитохрома P450». Natural Product Reports . 24 (3): 585–609. doi :10.1039/B604190F. PMID  17534532.
  4. ^ abcd Юнг, Санг; Лаучли, Райан; Арнольд, Фрэнсис (14 марта 2011 г.). «Цитохром P450: укрощение фермента дикого типа». Current Opinion in Biotechnology . 22 (6): 809–817. doi :10.1016/j.copbio.2011.02.008. PMC 3118264. PMID  21411308 . 
  5. ^ abcdefghi Fasan, Rudi (22 февраля 2012 г.). «Настройка ферментов P450 как катализаторов окисления». ACS Catalysis . 2 (4): 647–666. doi :10.1021/cs300001x. S2CID  4674699.
  6. ^ abcdefghij Wang, Z. Jane; Renata, Hans; Peck, Nicole; Farwell, Christopher; Coelho, Pedro; Arnold, Frances (5 мая 2014 г.). «Улучшенная циклопропанирующая активность гистидин-лигированного цитохрома P450 обеспечивает энантиоселективный формальный синтез левомилципрана». Angewandte Chemie International Edition на английском языке . 53 (26): 6810–6813. doi :10.1002/anie.201402809. PMC 4120663. PMID  24802161 . 
  7. ^ ab Dydio, P.; Key, H.; Nazarenko, A.; Rha, J.; Seyedkazemi, V.; Clark, D.; Hartwig, John (7 октября 2016 г.). «Искусственный металлофермент с кинетикой нативных ферментов». Science . 354 (6308): 102–106. Bibcode :2016Sci...354..102D. doi : 10.1126/science.aah4427 . PMID  27846500.
  8. ^ abcdefg Уайтхаус, Кристофер; Белл, Стивен; Вонг, Люэт-Лок (18 июля 2012 г.). «P450 BM3 (CYP102A1): соединяя точки». Chemical Society Reviews . 41 (3): 1218–1260. doi :10.1039/C1CS15192D. PMID  22008827.
  9. ^ ван Агтмаль, Михиль; Эггельте, Теунис; ван Бокстель, Крис (1 мая 1999 г.). «Препараты на основе артемизинина в лечении малярии: от лекарственных трав до зарегистрированных лекарств». Тенденции в фармакологических науках . 20 (5): 199–205. doi :10.1016/S0165-6147(99)01302-4. PMID  10354615.
  10. ^ abcde Шиварамакришнан, Сантош; Уэлле, Хьюз; Мацумура, Хиротоши; Гуань, Шэньхэн; Локкоз, Пьер; Берлингейм, Альма; Монтеллано, Пол (23 марта 2012 г.). «Донорство электронов проксимального лиганда и реакционная способность железо-пероксо-аниона цитохрома P450». Журнал Американского химического общества . 134 (15): 6673–6684. дои : 10.1021/ja211499q. ПМЦ 3329582 . ПМИД  22444582. 
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cytochrome_P450_engineering&oldid=1236901467"