Микроскопия когерентного комбинационного рассеяния

Микроскопия когерентного комбинационного рассеяния (CRS) — это метод многофотонной микроскопии, основанный на рамановских активных колебательных модах молекул . Двумя основными методами в микроскопии CRS являются стимулированное комбинационное рассеяние (SRS) и когерентное антистоксово комбинационное рассеяние (CARS) . SRS и CARS были теоретически предсказаны и экспериментально реализованы в 1960-х годах. ^{[1] [2] [3]} В 1982 году был продемонстрирован первый микроскоп CARS. ^[4] В 1999 году в лаборатории Сяоляна Санни Се в Гарвардском университете была разработана микроскопия CARS с использованием коллинеарной геометрии и объектива с высокой числовой апертурой . ^[5] Это достижение сделало метод более совместимым с современными лазерными сканирующими микроскопами . ^[6] С тех пор популярность CRS в биомедицинских исследованиях начала расти. CRS в основном используется для визуализации липидов, белков и других биомолекул в живых или фиксированных клетках или тканях без маркировки или окрашивания . ^[7] CRS также может использоваться для визуализации образцов, маркированных рамановскими метками, ^{[8] [9] [10],} что позволяет избежать помех от других молекул и обычно позволяет получать более сильные сигналы CRS, чем обычно получаются для обычных биомолекул. CRS также находит применение в других областях, таких как материаловедение ^[11] и экология. ^[12]

Когерентное комбинационное рассеяние основано на комбинационном рассеянии (или спонтанном комбинационном рассеянии). При спонтанном комбинационном рассеянии используется только один монохроматический возбуждающий лазер. Интенсивность сигнала спонтанного комбинационного рассеяния линейно растет со средней мощностью непрерывного лазера накачки . В CRS ^[7] два лазера используются для возбуждения определенных колебательных мод молекул, которые необходимо визуализировать. Лазер с более высокой энергией фотонов обычно называют лазером накачки, а лазер с более низкой энергией фотонов называют стоксовым лазером. Для того чтобы создать сигнал, их разности энергий фотонов должны соответствовать энергии колебательной моды:

${\displaystyle E_{Раман}=E_{насос}-E_{Стокса}}$,

где .${\displaystyle E_{Raman}=\hbar \Omega,\ E_{pump} =\hbar \omega _{pump},\ E_{Stokes} =\hbar \omega _{Stokes}}$

CRS — это нелинейный оптический процесс , где уровень сигнала обычно является функцией произведения мощностей лазеров накачки и Стокса. Поэтому большинство экспериментов по микроскопии CRS проводятся с импульсными лазерами , где более высокая пиковая мощность значительно улучшает уровни сигнала CRS. ^[13]

В CARS в качестве сигналов детектируются антистоксовы фотоны (имеющие большую энергию и меньшую длину волны, чем накачка).

${\displaystyle E_{CARS}=E_{насос}+\Omega =2\times E_{насос}-E_{Стокса}}$

В микроскопии CARS обычно существует два способа обнаружения вновь сгенерированных фотонов. Один называется CARS с прямым обнаружением, другой называется CARS с эпидетектированием. ^{[14] [15]} В CARS с прямым обнаружением сгенерированные фотоны CARS вместе с лазерами накачки и стоксовыми лазерами проходят через образец. Лазеры накачки и стоксовые лазеры полностью блокируются узкополосным фильтром с высокой оптической плотностью (OD) . Затем фотоны CARS детектируются фотоумножительной трубкой (ФЭУ) или ПЗС- камерой. В CARS с эпидетектированием обратно рассеянные фотоны CARS перенаправляются дихроичным зеркалом или поляризационным расщепителем луча . После использования фильтров с высокой OD для блокировки обратно рассеянных лазеров накачки и стоксовых лазеров вновь сгенерированные фотоны детектируются ФЭУ. Интенсивность сигнала CARS имеет следующую связь с интенсивностью накачки и стоксова лазера , числом молекул в фокусе лазеров и рамановской восприимчивостью третьего порядка молекулы: ^[16]${\displaystyle I_{насос},I_{Стокса}}$${\displaystyle N}$${\displaystyle \chi _{Раман}^{(3)}}$

${\displaystyle I_{CARS}\propto (N\chi _{Raman}^{(3)})^{2}I_{pump}^{2}I_{Stokes}}$

Отношение сигнал /шум (SNR), которое является более важной характеристикой в ​​экспериментах по визуализации, зависит от квадратного корня из числа сгенерированных фотонов CARS, которое приведено ниже: ^[16]

${\displaystyle SNR_{CARS}\propto N\chi _{Raman}^{(3)}I_{pump}{\sqrt {I_{Stokes}}}}$

Существуют и другие нелинейные оптические процессы, которые также генерируют фотоны на антистоксовой длине волны. Эти сигналы обычно называются фоном нерезонансного (NR) четырехволнового смешения (FWM) в микроскопии CARS. Этот фон может мешать сигналу CARS как конструктивно, так и деструктивно. ^[17] Однако эту проблему можно частично обойти, вычитая изображения on- и off-резонанса ^{[18] [19]} или используя математические методы для получения изображений без фона. ^[20]

В SRS интенсивность передачи энергии от длины волны накачки к длине волны стоксова лазера измеряется как сигнал. Существует два способа измерения сигналов SRS, один из которых заключается в измерении увеличения мощности в стоксовом лазере, что называется стимулированным усилением Рамана (SRG). Другой способ заключается в измерении уменьшения мощности в лазере накачки, что называется стимулированными потерями Рамана (SRL). Поскольку изменение мощности составляет порядка 10−3–10−6 ^{по сравнению} с исходной мощностью лазеров накачки и стоксова лазера, для извлечения сигналов SRS обычно используется схема передачи модуляции ^{[21] . [22]} Сигнал SRS зависит от мощности лазера накачки и стоксова лазера следующим образом:

${\displaystyle I_{SRS}\propto N\chi _{Raman}^{(3)}I_{pump}I_{Stokes}}$

Обнаружение с ограничением дробового шума может быть достигнуто, если электронный шум от детекторов будет значительно ниже оптического шума, а лазеры будут ограничены дробовым шумом на частоте обнаружения (частоте модуляции). В случае ограничения дробового шума отношение сигнал/шум (SNR) SRS ^[16] равно

${\displaystyle SNR_{SRL}\propto N\chi _{Raman}^{(3)}{\sqrt {I_{pump}}}I_{Stokes}}$

${\displaystyle SNR_{SRG}\propto N\chi _{Raman}^{(3)}I_{pump}{\sqrt {I_{Stokes}}}}$

Сигнал SRS свободен от нерезонансного фона, который мешает CARS-микроскопии, хотя может существовать гораздо меньший нерезонансный фон от других оптических процессов (например, перекрестной фазовой модуляции , многоцветного многофотонного поглощения ).

SRS может быть обнаружен как в прямом направлении, так и в эпи-направлениях. В SRS с прямым обнаружением модулированный лазер блокируется высокооптическим режекторным фильтром, а другой лазер измеряется фотодиодом. Модуляция, передаваемая от модулированного лазера к изначально немодулированному лазеру, обычно извлекается синхронным усилителем с выхода фотодиода. В SRS с эпи-обнаружением обычно существует два метода обнаружения сигнала SRS. Один метод заключается в обнаружении обратно рассеянного света перед объективом с помощью фотодиода с отверстием в центре. Другой метод аналогичен микроскопии CARS с эпи-обнаружением, где обратно рассеянный свет проходит через объектив и отклоняется в сторону светового пути, обычно с помощью комбинации поляризационного расщепителя луча и четвертьволновой пластины. Затем лазер Стокса (или накачки) обнаруживается после фильтрации накачки (или лазера Стокса).

Одна пара длин волн лазера дает доступ только к одной частоте колебаний. Визуализация образцов на разных волновых числах может обеспечить более специфическое и количественное химическое картирование образца. ^{[23] [24] [25] [26] [27] [28]} Этого можно достичь, визуализируя образцы на разных волновых числах один за другим. Эта операция всегда включает в себя какой-либо тип настройки: настройку одной из длин волн лазеров, настройку спектрального фильтрующего устройства или настройку временной задержки между лазерами накачки и стоксовыми лазерами в случае спектрально-фокусирующего CRS. Другой способ выполнения многоцветного CRS заключается в использовании одного пикосекундного лазера с узкой спектральной полосой пропускания (<1 нм) в качестве накачки или стоксового лазера, а другой лазер с широкой спектральной полосой пропускания. В этом случае спектр переданного широкополосного лазера может быть расширен решеткой и измерен массивом детекторов.

CRS обычно используют лазеры с узкополосными лазерами, полоса пропускания которых < 1 нм, для поддержания хорошего спектрального разрешения ~ 15 см ⁻¹ . Лазеры с полосой пропускания менее 1 нм являются пикосекундными лазерами. В CRS со спектральной фокусировкой фемтосекундные лазеры накачки и стоксовы лазеры одинаково линейно чирпируются в пикосекундные лазеры. ^{[29] [30] [31]} Эффективная полоса пропускания становится меньше, и поэтому высокое спектральное разрешение может быть достигнуто таким образом с помощью фемтосекундных лазеров, которые обычно имеют широкую полосу пропускания. Настройка волнового числа CRS со спектральной фокусировкой может быть достигнута как путем изменения центральной длины волны лазеров, так и путем изменения задержки между лазерами накачки и стоксовыми лазерами.

Одним из основных применений CRS является гистология без меток, которая также называется когерентной рамановской гистологией или иногда стимулированной рамановской гистологией. ^{[32] [33] [34] [35]} В CRH изображения CRS получаются на изображениях липидов и белков, и после некоторой обработки изображения можно получить изображение, похожее на окрашивание H&E . В отличие от окрашивания H&E, CRH можно проводить на живых и свежих тканях, и для этого не требуется фиксация или окрашивание.

Метаболизм малых молекул, таких как глюкоза, ^[36] холестерин, ^[37] и лекарства ^[38], изучается с помощью CRS в живых клетках. CRS обеспечивает способ измерения молекулярного распределения и количеств с относительно высокой пропускной способностью.

Миелин богат липидами. CRS обычно используется для визуализации миелина в живых или фиксированных тканях для изучения нейродегенеративных заболеваний или других нервных расстройств. ^{[39] [40] [41]}

Функции лекарств также могут быть изучены с помощью CRS. Например, противолейкозный препарат иматиниб изучается с помощью SRS на линиях лейкозных клеток. ^[38] Исследование выявило возможный механизм его метаболизма в клетках и дало представление о способах повышения эффективности лекарств.

Несмотря на то, что CRS позволяет получать изображения без меток, метки Рамана также могут использоваться для усиления сигнала для определенных целей. ^{[42] [9] [8]} Например, дейтерированные молекулы используются для смещения сигнала Рамана в полосу, где помехи от других молекул отсутствуют. Специально разработанные молекулы, содержащие изотопы, могут использоваться в качестве меток Рамана для достижения супермультиплексной многоцветной визуализации с помощью SRS. ^[10]

Конфокальная рамановская микроскопия обычно использует лазеры с непрерывной волной для получения спонтанного спектра Рамана в широком диапазоне волновых чисел для каждой точки изображения. Требуется много времени для сканирования всего образца, поскольку для получения данных каждому пикселю требуются секунды. Весь процесс формирования изображения длительный и, следовательно, он больше подходит для образцов, которые не двигаются. С другой стороны, CRS измеряет сигналы при одном волновом числе, но позволяет выполнять быстрое сканирование. Если требуется больше спектральной информации, можно использовать многоцветную или гиперспектральную CRS, и скорость сканирования или качество данных будут соответственно снижены. ^[43]

В микроскопии CRS мы можем рассматривать SRS и CARS как два аспекта одного и того же процесса. Сигнал CARS всегда смешивается с нерезонансным четырехволновым фоном смешения и имеет квадратичную зависимость от концентрации отображаемых химических веществ. SRS имеет гораздо меньший фон и линейно зависит от концентрации отображаемого химического вещества. Поэтому SRS больше подходит для количественной визуализации, чем CARS. Со стороны прибора, SRS требует модуляции и демодуляции (например, синхронный усилитель или резонансный детектор). Для многоканальной визуализации SRS требует многоканальной демодуляции, в то время как CARS нуждается только в массиве ФЭУ или ПЗС. Поэтому для SRS требуется более сложное оборудование, чем для CARS. ^[16]

Что касается чувствительности, SRS и CARS обычно обеспечивают схожую чувствительность. ^[44] Их различия в основном обусловлены методами обнаружения. В CARS-микроскопии в качестве детекторов для обнаружения фотонов, генерируемых в процессе CARS, используются ФЭУ, ЛФД или ПЗС. ФЭУ используются чаще всего из-за их большой области обнаружения и высокой скорости. В SRS-микроскопии фотодиоды обычно используются для измерения интенсивности лазерного луча. Из-за таких различий приложения CARS и SRS также различаются. ^[16]

ФЭУ обычно имеют относительно низкую квантовую эффективность по сравнению с фотодиодами. Это отрицательно скажется на SNR микроскопии CARS. ФЭУ также имеют пониженную чувствительность для лазеров с длиной волны более 650 нм. Поэтому с обычно используемой лазерной системой для CRS ( титан-сапфировый лазер ), CARS в основном используется для получения изображений в области высоких волновых чисел (2800–3400 см ⁻¹ ). SNR микроскопии CARS обычно плохое для получения изображений отпечатков пальцев (400–1800 см ⁻¹ ). ^[16]

Микроскопия SRS в основном использует кремниевые фотодиоды в качестве детекторов. Кремниевые фотодиоды имеют гораздо более высокую квантовую эффективность, чем ФЭУ, что является одной из причин того, что SNR SRS может быть лучше, чем CARS во многих случаях. Кремниевые фотодиоды также страдают от снижения чувствительности, когда длина волны лазера превышает 850 нм. Однако чувствительность все еще относительно высока и позволяет получать изображения в области отпечатков пальцев (400–1800 см ⁻¹ ). ^[16]