Кофакторная инженерия

Кофакторная инженерия , подвид метаболической инженерии , определяется как манипуляция использованием кофакторов в метаболических путях организма . В кофакторной инженерии концентрации кофакторов изменяются с целью максимизации или минимизации метаболических потоков. Этот тип инженерии может использоваться для оптимизации производства метаболитного продукта или повышения эффективности метаболической сети . Использование инженерии одноклеточных организмов для создания прибыльных химикатов из дешевого сырья растет, и кофакторная инженерия может играть решающую роль в максимизации производства. Эта область приобрела большую популярность за последнее десятилетие и имеет несколько практических применений в химическом производстве, биоинженерии и фармацевтической промышленности. ^[1]

Кофакторы — это небелковые соединения , которые связываются с белками и требуются для нормальной каталитической функциональности белков. Кофакторы можно считать «молекулами-помощниками» в биологической активности, и они часто влияют на функциональность ферментов. Кофакторы могут быть как органическими, так и неорганическими соединениями. Некоторые примеры неорганических кофакторов — это железо или магний, а некоторые примеры органических кофакторов — АТФ или кофермент А. Органические кофакторы более конкретно известны как коферменты , и многим ферментам требуется добавление коферментов для принятия нормальной каталитической функции в метаболической реакции. Коферменты связываются с активным сайтом фермента для содействия катализу. С помощью конструирования кофакторов и коферментов можно манипулировать естественной метаболической реакцией для оптимизации выхода метаболической сети. ^{[2] [3] [4]}

Кофакторы были открыты Артуром Харденом и Уильямом Янгом в 1906 году, когда они обнаружили, что скорость спиртового брожения в некипяченых дрожжевых экстрактах увеличивалась при добавлении кипяченого дрожжевого экстракта. ^[5] Несколько лет спустя Ганс фон Эйлер-Хельпин идентифицировал кофактор в кипяченом экстракте как НАД ⁺ . Другие кофакторы, такие как АТФ и кофермент А, были открыты позже в 1900-х годах. Механизм действия кофактора был открыт, когда Отто Генрих Варбург определил в 1936 году, что НАД ⁺ функционирует как акцептор электронов . После этих первых открытий ученые начали понимать, что манипулирование концентрациями кофакторов можно использовать в качестве инструментов для улучшения метаболических путей . ^[1]

Важной группой органических кофакторов является семейство молекул , называемых витаминами . Витамин B12 (кобаламин), например, играет решающую роль в организме человека, в то время как кофермент B12 , его производное, обнаруживается в метаболизме каждого типа клеток в нашем организме. Его присутствие влияет на синтез и регуляцию клеточной ДНК , а также принимает участие в синтезе жирных кислот и производстве энергии. Кофакторы требуются для многих важных метаболических путей , и возможно, что концентрации одного типа кофактора могут влиять на потоки многих различных путей.

Минералы и ионы металлов, которые организмы потребляют через свой рацион, являются яркими примерами неорганических кофакторов. Например, Zn ²⁺ необходим для помощи ферменту карбоангидразе , поскольку он преобразует углекислый газ и воду в бикарбонат и протоны. Широко признанным минералом, который действует как кофактор, является железо, которое необходимо для правильного функционирования гемоглобина , белка, переносящего кислород, обнаруженного в эритроцитах . Этот пример, в частности, подчеркивает важность кофакторов в метаболизме животных .

Кофакторная инженерия играет важную роль в манипулировании метаболическими путями . Метаболический путь — это ряд химических реакций, происходящих в организме. Метаболическая инженерия — это предмет изменения потоков в метаболическом пути. В метаболической инженерии метаболический путь может быть напрямую изменен путем изменения функциональности ферментов, участвующих в пути. Кофакторная инженерия предлагает особый подход и некоторые преимущества для изменения метаболического пути. Вместо изменения ферментов, используемых в пути, можно изменить кофакторы. Это может дать метаболическим инженерам преимущество из-за определенных свойств кофакторов и того, как их можно модифицировать.

Метаболические пути могут использоваться инженерами по метаболизму для создания желаемого продукта. Изменяя типы используемых кофакторов и время их использования, можно изменить результат работы метаболической сети. Чтобы увеличить производство продукта, инженеры по метаболизму могут снабжать сеть любым кофактором, который лучше всего подходит для этого конкретного процесса. Это приводит к оптимизации сетей для повышения производства желаемых продуктов. Кроме того, изменение кофакторов, используемых в сети, может быть гениальным решением сложной проблемы. Сеть, которая присутствует в клетке, но часто не используется, может иметь желаемый продукт. Вместо того, чтобы разрабатывать совершенно новый набор путей для производства продукта, можно применять кофакторную инженерию. Заменяя ферменты на использование кофакторов, которые легко доступны в клетке, обычно неиспользуемая сеть больше не ограничена кофакторами, и производство может быть увеличено.

Помимо изменения выхода метаболических сетей, изменение кофакторов, используемых в сети, может снизить эксплуатационные расходы при попытке сформировать желаемый продукт. NADH и NADPH являются двумя чрезвычайно распространенными клеточными кофакторами, отличающимися только наличием фосфатной группы. Однако эта фосфатная группа делает NADPH гораздо менее стабильным, чем NADH, и, следовательно, более дорогим для синтеза. Таким образом, выгодно попытаться использовать NADH в некоторых клеточных сетях, поскольку он часто дешевле, более доступен и выполняет ту же задачу, что и NADPH.

Кофакторная инженерия чаще всего имеет дело с манипуляцией микроорганизмами , такими как Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli , и, как таковая, требует использования методов рекомбинантной ДНК . Эти методы используют небольшие кольцевые сегменты ДНК , называемые плазмидами , которые могут быть введены и включены микроорганизмами, такими как Escherichia coli . Эти плазмиды специально разработаны в лабораториях для легкого включения и влияют на экспрессию различных белков , метаболитов и ферментов . Например, конкретная плазмида может вызвать изменение в аминокислотной последовательности фермента , что может увеличить его сродство к определенному субстрату .

Микроорганизмам требуется среда для роста, и одной из наиболее часто используемых для культур Escherichia coli является бульон Лурия-Бертани (LB). Эта среда часто дополняется глюкозой и часто содержит дополнительные молекулы , предназначенные для облегчения оптимального роста культуры. Затем предварительные культуры можно выращивать во встряхиваемых колбах. Это просто закупоренные колбы Эрленмейера , которые оставляются на орбитальном шейкере, вращающемся с очень высокой скоростью . Этот процесс аэрирует культуру, что необходимо для оптимального роста. После того, как предварительные культуры готовы, плазмиды, необходимые для конкретных экспериментов, добавляются к каждой культуре отдельно, а затем каждая культура переносится в биореактор. Биореакторы — это системы, которые позволяют культурам расти в контролируемой среде. Это оставляет введенные плазмиды единственной независимой переменной. Необходимая температура, pH , концентрации метаболитов и различные другие факторы окружающей среды могут поддерживаться биореактором, обеспечивая идентичные условия роста для каждой культуры.

После того, как образцы растут в реакторе в течение определенного периода, их можно извлечь и изучить, чтобы определить, очевидны ли предполагаемые изменения в организме. Поскольку кофакторная инженерия чаще всего имеет дело с метаболическими путями , эти организмы часто изучаются, но вводят специфические меченые флуоресцентные метаболиты и документируют их прогрессирование через различные пути. В других случаях результаты более очевидны и легко наблюдаемы, например, с уменьшением производства этанола дрожжами , о котором говорится ниже. ^{[3] [4]}

Биокатализаторы требуются для производства хиральных строительных блоков, необходимых в фармацевтических препаратах и ​​других химических веществах, используемых обществом. Многие такие биокатализаторы требуют NADPH в качестве кофактора . NADPH, кофактор, очень похожий на NADH, является и более дорогим, и менее стабильным, чем его аналог NADH . По этим причинам производители предпочли бы, чтобы биокатализаторы, которые они используют в своих производственных линиях, принимали NADH вместо NADPH. Инженерия кофакторов недавно добилась успеха в изменении ферментов, чтобы они предпочитали NADH в качестве кофактора вместо NADPH. В 2010 году группа ученых провела инженерию кофакторов на ферменте Gre2p, предпочитающей NADPH дегидрогеназе, обнаруженной в Saccharomyces cerevisiae . Gre2p восстанавливает соединение дикетон 2,5-гександион в хиральные строительные блоки (5S)-гидрокси-2-гексанон и (2S,5S)-гександиол. Ученые определили, что Asn9 ( аспарагин , позиция 9) является важной аминокислотой в активном центре Gre2p. В частности, Asn9 связывается с 3'-гидроксильной группой и 2'-атомом кислорода фрагмента аденилрибозы . С помощью прямого мутагенеза ученые заменили Asn9 как на Asp ( аспарагиновая кислота ), так и на Glu ( глутаминовая кислота ). Это изменение привело к снижению зависимости Gre2p от NADPH и повышению сродства к NADH. Это привело к повышению активности Gre2p при использовании NADH. Было отмечено, что замена Asn9 на Glu дала больший эффект, чем замена Asn9 на Asp. Asn содержит полярную незаряженную боковую цепь, в то время как и Asp, и Glu содержат полярную заряженную боковую цепь. Повышенный эффект Glu вызван дополнительным углеродом в его боковой цепи, который приближает его к фрагменту аденилрибозы. Это позволяет создать более прочные водородные связи между гидроксильными группами 2'- и 3'-рибозы и карбоксильной группой боковой цепи . Максимальная скорость реакции удвоилась при использовании NADH, когда Asn9 был заменен на Glu. С этими результатами ученые успешно спроектировали Gre2p так, чтобы он предпочитал NADH, а не NADPH, и увеличили скорость восстановления 2,5-гександиона. Это позволит химическим компаниям снизить свои производственные затраты, используя NADH вместо NADPH, по крайней мере, для этого конкретного восстановления. ^[6]

Альтернативным примером изменения предпочтения фермента к кофакторам является изменение реакции, зависящей от НАДН, на реакции, зависящие от НАДФН. В этом примере сами ферменты не изменяются, но вместо этого выбираются другие ферменты, которые выполняют ту же реакцию с использованием другого кофактора. Был создан сконструированный путь для получения 1-бутанола из ацетил-КоА путем изменения ферментов в метаболическом пути S. elongatus . Известно, что род Clostridium производит 1-бутанол, обеспечивая путь, который можно было бы вставить в S. elongatus. Этот путь синтезирует 1-бутанол с использованием пути обратного β-окисления. Ферменты, участвующие в этом новом сконструированном пути, были специфичны для НАДН, что было проблематично для воспроизведения пути в S. elongatus, поскольку цианобактерии производят гораздо больше НАДФН, чем НАДН.

Затем исследовательская группа путем биоразведки определила ферменты, которые используют НАДФН или как НАДФН, так и НАДН . Было обнаружено, что ацетоацетил-КоА-редуктаза (PhaB) является подходящей заменой гидроксимасляной дегидрогеназы (Hbd). Чтобы заменить AdhE2, исследователи обнаружили, что НАДФ-зависимая алкогольдегидрогеназа (YqhD) из E. coli эффективна для этого пути. Кроме того, исследователям нужна была дегидрогеназа для замены альдегиддегидрогеназной способности AdhE2. Было обнаружено, что КоА-ацилирующая бутиральдегиддегидрогеназа (Bldh) из C. saccharoperbutylacetonicum является хорошим вариантом. Вместе PhaB, Bldh, YqhD могут заменить Hbd и AdhE2, соответственно, чтобы изменить предпочтение кофактора восстановления 3-кетобутирил-КоА с использования НАДН на использование НАДФН. Затем авторы сконструировали различные комбинации различных ферментов (из тех, что обнаружены в обратном пути окисления и ферментов, использующих НАДФН) путем сверхэкспрессии различных генов в культурах S. elongatus PCC 7942. Для этого они сконструировали плазмиды, содержащие гены, соответствующие ферментам, и объединили их в геном S. elongates. После ферментных анализов штамм цианобактерий, экспрессирующий ферменты, использующие НАДФН, продуцировал наибольшее количество 1-бутанола (29,9 мг/л), что превышает количество штаммов, которые не состояли из ферментов, использующих НАДФН, в четыре раза. В целом, 1-бутанол продуцировался в S. elongatus с использованием пути из другого организма. Этот путь был модифицирован для того, чтобы соответствовать предпочтительному восстанавливающему кофактору для цианобактерий. ^[7]

В кофакторной инженерии метаболический путь изменяется путем изменения концентраций определенных кофакторов, которые производятся либо в этом конкретном пути, либо в отдельном пути. Например, гипотетический организм может иметь два произвольных пути, называемых A и B, где некоторые ферменты в обоих A и B используют одни и те же кофакторы. Если ученые хотят уменьшить выход пути A, они могут сначала рассмотреть возможность прямой инженерии ферментов, участвующих в A, возможно, для уменьшения сродства определенного активного центра к его субстрату . Однако в некоторых случаях ферменты в A могут быть трудно инженерными по разным причинам, или их может быть невозможно инженерными без опасного воздействия на какой-либо третий метаболический путь C, который использует те же ферменты. В качестве отдельного варианта ученые могли бы увеличить поток B, что может быть проще в инженерии. Это, в свою очередь, может «связать» кофакторы, необходимые для A, что замедлит ферментативную активность , уменьшив выход в A. Это один гипотетический пример того, как может использоваться инженерия кофакторов, но есть много других уникальных случаев, когда ученые используют кофакторы как способ изменения метаболических путей. Главным преимуществом инженерии кофакторов является то, что ученые могут использовать ее для успешного изменения метаболических путей, которые трудно спроектировать с помощью обычной метаболической инженерии. Это достигается путем нацеливания на более легко сконструированные ферменты в отдельных путях, которые используют те же кофакторы. Поскольку многие кофакторы используются различными ферментами в нескольких путях, инженерия кофакторов может быть эффективной и экономически выгодной альтернативой текущим методам метаболической инженерии. ^[8]

Дрожжи обычно используются в пивной и винной промышленности, поскольку они способны эффективно производить этанол через метаболический путь ферментации в отсутствие кислорода. Для ферментации требуется фермент глицерол-3-фосфатдегидрогеназа (ГПДГ), который зависит от кофактора НАДН . Этот путь включает преобразование глюкозы как в этанол, так и в глицерин , оба из которых используют НАДН в качестве кофактора . Ученые сконструировали Saccharomyces cerevisiae для сверхпродукции ГПДГ, что сместило метаболический поток клеток от этанола к глицерину, ограничив доступность НАДН в части пути производства этанола. Противоположный эффект был достигнут путем воздействия на отдельный путь в клетке, путь синтеза глутамата . Инактивация экспрессии фермента глутаматдегидрогеназы , которая зависит от НАДФН , и чрезмерная экспрессия ферментов глутаминсинтетазы и глутаматсинтетазы , которые полагаются на НАДН в качестве кофактора, сместили баланс кофакторов в пути синтеза глутамата. Теперь путь зависит от НАДН, а не от НАДФН, что снижает доступность НАДН в пути ферментации. Это, в свою очередь, вызывает увеличение производства этанола и снижение производства глицерина . Этот метод манипулирования метаболическими потоками можно визуализировать так же, как мировые топливные рынки, где увеличение производства этанола для использования в автомобильной промышленности приведет к снижению его доступности в пищевой промышленности. По сути, производство большего количества двигателей, работающих на этаноле, может привести к снижению потребления обработанных сладостей, которые содержат кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы . Такая разработка кофакторов применима к пивной и винной промышленности, поскольку она позволяет регулировать уровни этанола в алкогольных напитках. Достижения в винодельческой промышленности привели к постоянному росту содержания этанола, поэтому виноделы, в частности, были бы заинтересованы в возможности снижения уровня этанола в некоторых из своих вин. ^[3]

Коэнзим А (КоА) и ацетил-КоА являются двумя промежуточными метаболитами , наиболее заметно обнаруженными в цикле лимонной кислоты , которые участвуют в более чем 100 различных реакциях метаболизма микроорганизмов . Недавние эксперименты показали, что повышенная экспрессия фермента пантотенаткиназы и добавление пантотеновой кислоты в путь биосинтеза КоА позволили скорректировать потоки как КоА, так и ацетил-КоА. Эта повышенная концентрация кофакторов привела к увеличению потока углерода в пути синтеза изоамилацетата , повышению эффективности производства изоамилацетата. Изоамилацетат используется в промышленности для искусственных ароматизаторов и для тестирования эффективности респираторов . В дополнение к производству изоамилацетата, манипуляция биосинтезом КоА во время реакции пируватгидрогеназы также вызывает увеличение производства как сукцината , так и ликопина , каждый из которых оказывает благотворное воздействие на организм человека. Увеличение концентрации сукцината, который используется в качестве катализатора , может привести к увеличению скорости цикла лимонной кислоты и, следовательно, метаболизма человека . Было показано, что увеличение концентрации ликопина снижает риск рака простаты . Потенциальные выгоды от повторения такого подвига инженерии кофакторов и успешного внедрения их в практику промышленности бесчисленны. ^{[4] [9] [10]}

Многие важные промышленные ферменты используют кофакторы для катализа реакций. Используя кофакторы для управления метаболическими путями , можно снизить стоимость материалов, исключить этапы производства, сократить время производства, уменьшить загрязнение и повысить общую эффективность производства. Один случай, демонстрирующий несколько из этих преимуществ производства, касается генной инженерии осин . В процессе производства бумаги производственные предприятия должны расщеплять лигнин , биохимическое соединение, которое придает стволу дерева жесткость, чтобы сформировать целлюлозу, используемую на протяжении всего остального производства. Процесс химической варки целлюлозы требует от производственного предприятия использования значительного количества энергии, а также многих дорогих и токсичных химикатов. Группа генных инженеров с помощью инженерии кофакторов спроектировала генетически превосходную осину , которая производила меньше лигнина. Эти генетически модифицированные деревья позволили бумажным фабрикам сократить свои затраты, загрязнение и время производства. ^{[1] [11]}

Краткое описание других значимых примеров использования кофакторной инженерии.