Клиническое метагеномное секвенирование

В этой статье отсутствует информация о клиническом использовании секвенирования третьего поколения (длинного чтения) . Пожалуйста, расширьте статью, чтобы включить эту информацию. Дополнительные сведения могут быть на странице обсуждения . ( Январь 2020 г. )

Клиническое метагеномное секвенирование нового поколения ( mNGS ) — это комплексный анализ микробного и хозяйского генетического материала ( ДНК или РНК ) в клинических образцах пациентов с помощью секвенирования нового поколения . Он использует методы метагеномики для идентификации и характеристики генома бактерий , грибков , паразитов и вирусов без необходимости предварительного знания конкретного патогена непосредственно из клинических образцов. Возможность обнаружения всех потенциальных патогенов в образце делает метагеномное секвенирование нового поколения мощным инструментом в диагностике инфекционных заболеваний, особенно когда другие более направленные анализы, такие как ПЦР , не дают результата. Его ограничения включают клиническую полезность, лабораторную валидность, смысл и чувствительность, стоимость и нормативные соображения. ^[1]

За пределами клинической медицины проводится аналогичная работа по идентификации генетического материала в образцах окружающей среды, таких как пруды или почва. ^[2]

Секвенирование следующего поколения использует методы метагеномики для идентификации и характеристики генома бактерий , грибков , паразитов и вирусов без необходимости предварительного знания конкретного патогена непосредственно из клинических образцов. ^[3] Возможность обнаружения всех потенциальных патогенов в образце делает метагеномное секвенирование следующего поколения мощным инструментом в диагностике инфекционных заболеваний, особенно когда другие более направленные анализы, такие как ПЦР , не дают результата. ^[4]

Типичный рабочий процесс mNGS состоит из следующих этапов:

• Получение образцов: наиболее часто используемые образцы для метагеномного секвенирования — это кровь , кал, спинномозговая жидкость (СМЖ), моча или мазки из носоглотки . Среди них кровь и СМЖ являются самыми чистыми, имеющими меньше фонового шума, в то время как другие, как ожидается, будут иметь большое количество комменсалов и/или оппортунистических инфекций и, следовательно, иметь больше фонового шума. ^[2] Образцы следует собирать с большой осторожностью, так как хирургические образцы могут быть загрязнены во время обработки биопсии ; например, люмбальные пункции для получения образцов СМЖ могут быть загрязнены во время процедуры. ^[4]
• Извлечение РНК/ДНК: ДНК и РНК образца извлекаются с помощью набора для извлечения. Если есть сильное предыдущее подозрение относительно состава генома патогена и поскольку количество нуклеиновой кислоты патогена в более шумных образцах подавлено РНК/ДНК других организмов, выбор набора для извлечения только РНК или ДНК будет более конкретным и удобным подходом. Некоторые коммерчески доступные наборы, например, RNeasy PowerSoil Total RNA kit ( Qiagen ), RNeasy Minikit (Qiagen), MagMAX Viral Isolation kit (ABI), Viral RNA Minikit (Qiagen). ^[2]
• Стратегии оптимизации для подготовки библиотеки: из-за высокого уровня фонового шума в метагеномном секвенировании было разработано несколько процедур обогащения мишеней, которые направлены на увеличение вероятности захвата транскриптов и/или геномов, полученных от патогенов. Обычно существует два основных подхода, которые можно использовать для увеличения количества сигнала патогена в образце: отрицательный отбор и положительное обогащение. ^{[2] [3]}

1. Отрицательный отбор (фоновое истощение или вычитание) нацелен на устранение геномного фона хозяина и микробиома, при этом стремясь сохранить нуклеиновую кислоту, полученную из интересующих патогенов. Деградация геномного фона может быть выполнена посредством широкого спектра переваривания нуклеазами , такими как ДНКаза I для фона ДНК, или путем удаления обильных видов РНК (рРНК, мтРНК, глобиновая мРНК) с использованием наборов для истощения РНК, специфичных для последовательности. Также подходы на основе CRISPR-Cas9 могут быть выполнены для нацеливания и истощения митохондриальной РНК человека, например. Однако, как правило, подходы вычитания приводят к определенной степени потери целевого генома патогена, поскольку во время очистки может возникнуть плохое восстановление. ^[2]
2. Положительное обогащение используется для усиления сигнала патогена, а не для снижения фонового шума. Обычно это делается посредством захвата цели на основе гибридизации зондами, которые используются для извлечения интересующей нуклеиновой кислоты для последующей амплификации и секвенирования. Было показано, что панвирусные зонды успешно идентифицируют различные типы патогенов в различных клинических жидкостях и респираторных образцах и использовались для секвенирования и характеристики новых вирусов. Однако подход с зондом включает дополнительные этапы гибридизации и очистки, требующие более высокого ввода образца, увеличивая риск потери цели и увеличивая стоимость и практическое время. ^[2]

• Высокопроизводительное секвенирование: все фрагменты нуклеиновых кислот библиотеки секвенируются. Выбор платформы секвенирования зависит от различных факторов, таких как цели исследования лаборатории, личный опыт и уровень навыков. До сих пор система Illumina MiSeq оказалась наиболее часто используемой платформой для исследования инфекционных заболеваний, наблюдения за патогенами и обнаружения патогенов в исследованиях и общественном здравоохранении. Инструмент достаточно компактен, чтобы поместиться на лабораторном столе, имеет быстрое время работы по сравнению с другими аналогичными платформами и имеет сильное сообщество поддержки пользователей. Однако с дальнейшими улучшениями этой технологии и с дополнительным снижением ошибок и стабилизацией программного обеспечения MinION может стать отличным дополнением к арсеналу современных технологий секвенирования для рутинного наблюдения, особенно в небольших лабораториях с ограниченными ресурсами. Например, MinION успешно использовался в проекте ZiBRA для наблюдения за вирусом Зика в реальном времени у комаров и людей в Бразилии и в Гвинее для осуществления наблюдения в реальном времени во время продолжающейся вспышки Эболы . ^{[5] [6]} В целом, для ограниченных ресурсов используются IlluminaMiSeq, iSeq, Ion Torrent PGM, Oxford Nanopore, MinION. В то время как для существенных ресурсов предпочтительны Illumina NextSeq, NovaSeq, PacBio Sequel, Oxford Nanopore и PromethION. Более того, для секвенирования патогенов использование контролей имеет принципиальное значение, обеспечивая качество анализа mNGS и стабильность с течением времени; PhiX используется в качестве контроля секвенирования, затем другие контроли включают положительный контроль, дополнительный внутренний контроль (например, ДНК с шипами или другой известный патоген) и отрицательный контроль (обычно образец воды). ^[2]
• Биоинформатический анализ: в то время как само секвенирование стало широкодоступным и более удобным для пользователя, последующий анализ и интерпретация данных по-прежнему требуют специализированной биоинформатической экспертизы и соответствующих вычислительных ресурсов. Необработанные данные с платформы секвенирования обычно очищаются, обрезаются и фильтруются для удаления некачественных и дублирующихся прочтений. Удаление прочтений генома / транскриптома хозяина выполняется для уменьшения фонового шума (например, прочтений хозяина и окружающей среды) и увеличения частоты прочтений патогенов. Этот шаг также сократит время последующего анализа. Дальнейшее удаление фонового шума достигается путем сопоставления прочтений образца с прочтениями из отрицательного контроля для обеспечения устранения любых загрязняющих прочтений, таких как те, которые связаны с реагентами или средой хранения образцов. Оставшиеся прочтения обычно собираются de novo для получения длинных участков последовательностей, называемых контигами . Таксономическая идентификация полученных контигов выполняется путем сопоставления их с геномами и последовательностями в базах данных нуклеотидов или белков; для этого чаще всего используются различные версии BLAST . Также может быть выполнена расширенная характеристика бактериальных организмов, что позволяет получить необходимую глубину и широту охвата для результатов генетической характеристики. Генный вызов может быть выполнен различными способами, включая RAST или с использованием услуг NCBI во время подачи полного генома. Результаты нескольких инструментов аннотации можно сравнить на точность и полноту и, при необходимости, объединить с помощью BEACON. Для характеристики генов устойчивости к антибиотикам обычно используется идентификатор гена устойчивости из комплексной базы данных устойчивости к антибиотикам (CARD). Для характеристики генов факторов вирулентности ShortBRED предлагает анализы с настраиваемой базой данных из базы данных факторов вирулентности. ^[2]

Одним из способов обнаружения этих патогенов является определение части их генома с помощью метагеномного секвенирования ( секвенирование следующего поколения - mNGS), которое может быть целевым или нецелевым. ^[3]

Из-за этого чувствительность к обнаружению целевых микроорганизмов обычно повышается, но это сопровождается ограничением количества идентифицируемых патогенов. ^[3]

Нецелевой анализ представляет собой метагеномный подход к секвенированию Shotgun . Вся ДНК и/или РНК секвенируется с помощью этого подхода с использованием универсальных праймеров . Полученные mNGS-чтения могут быть собраны в частичные или полные геномы. Эти геномные последовательности позволяют отслеживать вспышки заболеваний в больницах, чтобы облегчить контроль за инфекциями и надзор за общественным здравоохранением. Кроме того, их можно использовать для субтипирования (идентификации определенного генетического варианта микроорганизма). ^{[ необходима цитата ]}

Нецелевой mNGS является наиболее перспективным подходом для анализа клинических образцов и предоставления комплексной диагностики инфекций. Различные группы подтвердили mNGS в поправках по улучшению клинических лабораторий (CLIA), таких как менингит или энцефалит, сепсис и пневмония. ^[3] Этот метод может быть очень полезен в условиях, когда не предполагается точная инфекционная этиология. ^[7] Например, у пациентов с подозрением на пневмонию идентификация основной инфекционной этиологии, как при COVID-19, имеет важные клинические и общественно-медицинские последствия. ^{[8] [7]}

Традиционный метод заключается в формулировании дифференциального диагноза на основе истории болезни пациента, клинической картины, результатов визуализации и лабораторных исследований. Но здесь предлагается другой способ диагностики; метагеномное секвенирование следующего поколения (NGS) является многообещающим методом, поскольку комплексный спектр потенциальных причин (вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных) может быть идентифицирован с помощью одного анализа. ^[3]

Ниже приведены некоторые примеры применения метагеномного секвенирования в диагностике инфекционных заболеваний. ^{[ необходима ссылка ]}

Традиционный метод, используемый для диагностики инфекционных заболеваний, был оспорен в некоторых случаях: нейровоспалительные заболевания, отсутствие диагностических тестов для редких патогенов и ограниченная доступность и объем образцов центральной нервной системы (ЦНС) из-за необходимости инвазивных процедур. Из-за этих проблем некоторые анализы предлагают другой способ диагностики, который является метагеномным секвенированием следующего поколения (NGS). Подводя итог, NGS может идентифицировать широкий спектр патогенов в одном тесте. ^[9]

Некоторые исследования оценивают клиническую полезность метагеномного NGS для диагностики неврологических инфекций параллельно с традиционным микробиологическим тестированием. Было замечено, что наивысший диагностический выход был получен при сочетании метагеномного NGS СМЖ и традиционного тестирования, включая серологическое тестирование и тестирование образцов других типов, помимо СМЖ. ^[9] Иногда неврологические инфекции остаются недиагностированными у части пациентов, несмотря на традиционное тестирование. ^[9]

Результаты метагеномного NGS также могут быть ценными, даже если они совпадают с результатами традиционного тестирования, не только подтверждая правильность диагноза, полученного традиционным способом, но и потенциально выявляя или исключая сопутствующие инфекции, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом. ^[9]

В настоящее время для обнаружения резистентности различных микробов используется метод, называемый чувствительностью к антибиотикам (AST) , но несколько исследований обнаружили, что бактериальная резистентность находится в геноме и передается горизонтальным путем (HGT) , поэтому разрабатываются методы секвенирования для облегчения идентификации и характеристики этих геномов и метагеномов. На данный момент существуют следующие методы обнаружения резистентности к антимикробным препаратам: ^[10]

• Чувствительность к антибиотикам: преимущество этого метода в том, что он дает информацию для лечения пациентов. Есть также некоторые недостатки, один из них в том, что этот метод полезен только для культивируемых бактерий, для которых требуется компетентный персонал. ^[10]
• Методы секвенирования: некоторые преимущества этих методов по сравнению с методом AST заключаются в том, что они быстрые и разумные, они полезны как для бактерий, которые растут на искусственных средах, так и для тех, которые не растут, и позволяют сравнивать исследования на нескольких организмах. Один тип метода секвенирования может быть использован вместо другого в зависимости от типа образца, для геномного образца используются методы, основанные на сборке; для метагеномного образца предпочтительнее использовать методы, основанные на чтении . ^[10]

Методы метагеномного секвенирования дали лучшие результаты, чем геномные, из-за меньшего количества ложноотрицательных результатов. В рамках метагеномного секвенирования функциональная метагеномика является мощным подходом для характеристики резистомов ; метагеномная библиотека создается путем клонирования общей ДНК сообщества, извлеченной из образца, в вектор экспрессии , эта библиотека анализируется на устойчивость к противомикробным препаратам путем высева на селективные среды, которые летальны для хозяина дикого типа. Затем выбранные вставки из выживших рекомбинантных, устойчивых к противомикробным препаратам клеток-хозяев секвенируются, а полученные последовательности впоследствии собираются и аннотируются (PARFuMS). ^{[10] [11]}

Функциональная метагеномика позволила открыть несколько новых механизмов устойчивости к противомикробным препаратам и связанных с ними генов, одним из таких примеров является недавно обнаруженный механизм устойчивости к тетрациклину с помощью тетрациклиндеструктаз. ^[10] Важно учитывать не только последовательность и механизм гена устойчивости к противомикробным препаратам, но и геномный контекст, вид бактерий-хозяев и географическое положение ( метагеном ). ^[10]

Потенциально опасные патогены, такие как вирусы Эболы , коронавирусы и т. д., а также ближайший генетический родственник неизвестных патогенов, могут быть идентифицированы немедленно, что побудит к дальнейшему наблюдению. Его роль в будущей готовности к пандемии ожидается, и он может существовать как самая ранняя система наблюдения, которая может нам понадобиться для обнаружения вспышек неизвестной этиологии и своевременного реагирования. ^[12]

Использование mNGS для характеристики микробиома сделало возможным разработку бактериальных пробиотиков, которые можно вводить в виде таблеток, например, для лечения заболеваний, связанных с Clostridioides difficile . ^[3]

Изучение экспрессии генов позволяет охарактеризовать множество инфекций, например, инфекции, вызванные золотистым стафилококком , болезнью Лайма , кандидозами , туберкулезом и гриппом . Также этот подход может быть использован для классификации рака . ^{[ необходима цитата ]}

Анализ РНКсек имеет много других целей и применений, таких как выявление новых или недооцененных взаимодействий хозяина и микроба непосредственно из клинических образцов, постановка косвенного диагноза на основе реакции хозяина-человека на патоген и различение инфекционных и неинфекционных причин острых заболеваний. ^[3]

Большинство полученных данных о результатах метагеномики состоят из отчетов о случаях , которые опровергают растущий интерес к диагностической метагеномике. ^[13]

Соответственно, наблюдается общее отсутствие проникновения этого подхода в клиническую микробиологическую лабораторию, поскольку постановка диагноза с помощью метагеномики по-прежнему полезна только в контексте описания случая, но не для истинной ежедневной диагностической цели. ^[13]

По состоянию на 2018 год моделирование экономической эффективности метагеномики при диагностике лихорадки неизвестного происхождения пришло к выводу, что даже после ограничения стоимости диагностической метагеномики до 100–1000 долларов США за тест, для достижения нейтральности затрат потребуется в 2,5–4 раза большая диагностическая ценность, чем при использовании компьютерной томографии брюшной полости и таза , и предостерегло от «широкомасштабной спешки» при внедрении метагеномного тестирования. ^[13]

Кроме того, в случае открытия потенциальных новых инфекционных агентов , как правило, публикуются только положительные результаты, хотя подавляющее большинство секвенированных случаев являются отрицательными, что приводит к очень предвзятой информации. Кроме того, большинство работ по открытию, основанных на метагеномике, которые предшествуют диагностическим работам, даже упоминают известные агенты, обнаруженные при скрининге нераскрытых случаев на предмет совершенно новых причин. ^[13]

На сегодняшний день большинство опубликованных тестов проводились непроверенным, неотчетным образом. «Стандартное микробиологическое тестирование», которому подвергаются образцы перед метагеномикой, является изменчивым и не включает тестирование полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) на распространенные респираторные вирусы или, как правило, тестирование 16S/ITS ПЦР. ^[13]

Учитывая относительные затраты на проверку и выполнение метагеномного ПЦР-тестирования по сравнению с 16S/ITS, второй вариант считается более простым и эффективным. Потенциальным исключением из 16S/ITS-тестирования является кровь, учитывая огромное количество доступной последовательности 16S, что делает чистые отсечки для диагностических целей проблематичными. ^[13]

Более того, почти все организмы, обнаруженные метагеномикой, для которых существует соответствующее лечение и которые, таким образом, действительно могут быть действенными, также обнаруживаются с помощью тестирования 16S/ITS (или 16S/ITS-NGS). Это ставит под сомнение полезность метагеномики во многих диагностических случаях. ^[13]

Одним из основных моментов для достижения лабораторной валидности является наличие эталонных стандартов и контролей при выполнении анализов mNGS. Они необходимы для обеспечения качества и стабильности этой методики с течением времени. ^[3]

В клинических микробиологических лабораториях количественное определение микробной нагрузки считается рутинной функцией, поскольку оно связано с тяжестью и прогрессированием заболевания. Для достижения хорошего количественного определения необходима высокая чувствительность метода. ^[13]

В то время как мешающие вещества представляют собой общую проблему для клинической химии или ПЦР-диагностики, степень вмешательства со стороны хозяина (например, в биопсиях тканей ) или непатогенных нуклеиновых кислот (например, в кале) в метагеномике является новым поворотом. ^{[3] [13]} Кроме того, из-за относительного размера человеческого генома по сравнению с микробными геномами вмешательство может происходить при низких уровнях загрязняющего материала. ^[13]

Еще одной проблемой клинической метагеномики в отношении чувствительности является диагностика коинфекций , где присутствуют патогены с высоким титром, которые могут давать смещенные результаты, поскольку они могут непропорционально поглощать считывания и затруднять различение менее распространенных патогенов. ^[13]

В дополнение к проблемам с интерферирующими веществами, особенно в области диагностики, точная количественная оценка и чувствительность имеют важное значение, поскольку путаница в результатах может повлиять на третье лицо, пациента. По этой причине практикующие специалисты в настоящее время должны быть остро осведомлены о проблемах с подменой индексов, связанных с секвенированием Illumina, что может привести к отслеживанию неправильно штрихкодированных образцов. ^[13]

Поскольку метагеномика обычно использовалась на пациентах, у которых все остальные тесты до сих пор были отрицательными, вопросы, связанные с аналитической чувствительностью, были менее уместны. Но для исключения причин инфекций, что является одной из наиболее важных ролей клинической метагеномики, необходимо иметь возможность выполнять достаточно глубокое секвенирование для достижения адекватной чувствительности. Одним из путей может быть разработка новых методов подготовки библиотеки. ^[13]

По состоянию на 2018 год монополия Illumina на высококачественные реагенты для секвенирования следующего поколения привела к тому, что только реагенты для секвенирования стоят дороже, чем одобренные FDA панели для синдромного тестирования. Также необходимо учитывать дополнительные прямые затраты на метагеномику, такие как извлечение, подготовка библиотеки и вычислительный анализ. ^[13] В целом, метагеномное секвенирование наиболее полезно и экономически эффективно для обнаружения патогенов , когда выполняется хотя бы один из следующих критериев:

1. идентификация организма недостаточна (желательно выйти за рамки открытия, чтобы получить данные для геномной характеристики),
2. подозревается коинфекция ,
3. другие более простые анализы неэффективны или займут чрезмерно много времени,
4. Скрининг образцов окружающей среды на предмет ранее неописанных или отличающихся патогенов. ^[2]

• Секвенирование
• Управление клиническими данными
• Секвенирование нанопор

• Поправки CDC по улучшению работы клинических лабораторий
• Улучшенная аннотация детерминант устойчивости к антибиотикам выявляет кластеры микробных резистомов по экологии Статья о функциональных метагеномных отборах для устойчивости