Расчесывание хромосом

Для проверки этой статьи нужны дополнительные цитаты . Помогите улучшить эту статью , добавив ссылки на надежные источники . Материалы без ссылок могут быть оспорены и удалены. Найти источники:  "Chromosome combing" – новости  · газеты  · книги  · ученый  · JSTOR ( декабрь 2007 г. ) ( Узнайте, как и когда удалять это сообщение )

Расчесывание хромосом (также известное как молекулярное расчесывание или расчесывание ДНК) ^[1] — это метод, используемый для получения массива равномерно растянутой ДНК , который затем отлично подходит для исследований гибридизации нуклеиновых кислот , таких как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), преимуществами которой являются равномерность растяжения, легкий доступ к целевым последовательностям гибридизации ^[2] и разрешение, обеспечиваемое большим расстоянием между двумя зондами, что обусловлено растяжением ДНК в 1,5 раза по сравнению с кристаллографической длиной ДНК.

ДНК в растворе (т. е. со случайно скрученной структурой) растягивается путем втягивания мениска раствора с постоянной скоростью (обычно 300 мкм/с). Концы цепей ДНК, которые считаются изношенными (т. е. открытыми и обнажающими полярные группы), связываются с ионизируемыми группами, покрывающими силанизированную стеклянную пластину при pH ниже pKa ионизируемых групп (гарантируя, что они достаточно заряжены для взаимодействия с концами ДНК). Остальная часть ДНК, которая в основном представляет собой двухцепочечную ДНК, не может образовывать эти взаимодействия (за исключением нескольких «приземляющихся» сегментов по длине цепи ДНК), поэтому доступна для гибридизации с зондами. По мере втягивания мениска поверхностное удержание создает силу, которая действует на ДНК, удерживая ее в жидкой фазе; однако эта сила уступает силе прикрепления ДНК; в результате ДНК растягивается при переходе в воздушную фазу; Поскольку сила действует в локальности воздушно-жидкой фазы, она инвариантна к различным длинам или конформациям ДНК в растворе, поэтому ДНК любой длины будет растягиваться так же, как втягивается мениск. Поскольку это растяжение постоянно по длине ДНК, расстояние вдоль цепи может быть связано с содержанием оснований; 1 мкм приблизительно эквивалентен 2 кб.

Интересующие области ДНК наблюдаются путем гибридизации их с зондами, мечеными гаптенами , такими как биотин ; затем это может быть связано одним или несколькими слоями лигандов, ассоциированных с флуорохромом (такими как иммунофлуоресцентные антитела). Также возможно многоцветное мечение. Это имеет несколько потенциальных применений, как правило, как метод физического картирования с высоким разрешением (например, для позиционного клонирования), примером которого было правильное картирование 200 кб области гена CAPN3 или картирование неперекрывающихся последовательностей (поскольку расстояние между двумя зондами может быть точно измерено). Поэтому это полезно для поиска экзонов, микроделеций, амплификации или перестроек. До улучшения гребня FISH имел слишком низкое разрешение, чтобы быть полезным в этом случае. При использовании этого метода разрешение FISH теоретически ограничено только разрешением эпифлуоресцентного микроскопа ; на практике достигаются разрешения около 2 мкм для молекул ДНК, обычно длиной 200–600 кб (хотя гребенчатая FISH использовалась с некоторым успехом для молекул длиной более 1 Мб), и могут быть возможности для улучшения путем оптимизации. Поскольку анализы ДНК с использованием этой техники являются одномолекулярными, геномы из разных клеток можно сравнивать для поиска аномалий, что имеет значение для диагностики рака и других генетических изменений.

Расчесывание хромосом также используется для изучения репликации ДНК , строго регулируемого процесса, который зависит от определенной программы временного и пространственного распределения активации точек начала репликации . Каждая точка начала занимает отдельный генетический локус и должна активироваться только один раз за клеточный цикл . Расчесывание хромосом позволяет получить представление о срабатывании точек начала репликации и распространении репликационных вилок по всему геному . Поскольку не делается никаких предположений о последовательности точек начала репликации, этот метод особенно полезен для картирования точек начала репликации у эукариот , которые, как считается, не имеют точно определенных последовательностей начала.

Стратегии, включающие расчесывание недавно реплицированной ДНК, обычно включают включение модифицированных нуклеотидов (таких как BrdU, бромдезоксиуридин ) в зарождающуюся ДНК, а затем ее флуоресцентное обнаружение. Поскольку репликационные вилки распространяются двунаправленно от точек начала репликации с (приблизительно) одинаковой скоростью, ^[3] тогда можно сделать вывод о положении точки начала. Замена модифицированного нуклеотидного пула другим типом модифицированных нуклеотидов через определенное время позволяет разработать разрешенную во времени картину срабатывания сайтов и кинетику репликационных вилок. Можно идентифицировать сайты пауз, разрешить объединенные репликационные вилки и изучить частоту срабатывания точек начала репликации в различные периоды времени.

В исследованиях in vitro экстракта яиц Xenopus laevis частота срабатывания показала увеличение по мере прогрессирования фазы S. В другом исследовании ^[4] по эписомам вируса Эпштейна-Барр гибридизированные зонды использовались для визуализации регионального распределения событий срабатывания; определенная зона показала предпочтение срабатыванию, в то время как также были выведены несколько участков паузы.

Расчесывание хромосом выполняется компанией Genomic Vision, базирующейся в Париже.