Бесклеточная система

Бесклеточная система — это инструмент in vitro, широко используемый для изучения биологических реакций , происходящих внутри клеток, помимо полной клеточной системы, что позволяет сократить сложные взаимодействия, обычно обнаруживаемые при работе с целой клеткой. [1] Субклеточные фракции можно изолировать с помощью ультрацентрифугирования , чтобы получить молекулярные механизмы, которые можно использовать в реакциях в отсутствие многих других клеточных компонентов. [2] Внутренние структуры эукариотических и прокариотических клеток использовались для создания этих упрощенных сред. [3] [4] Эти системы позволили появиться бесклеточной синтетической биологии , обеспечив контроль над тем, какая реакция исследуется, а также ее выход, и уменьшая соображения, которые в противном случае возникали бы при работе с более чувствительными живыми клетками. [5]

Типы

Системы, не содержащие клеток, можно разделить на две основные классификации: основанные на клеточных экстрактах, которые удаляют компоненты из целой клетки для внешнего использования, и основанные на очищенных ферментах, которые используют очищенные компоненты молекул, которые, как известно, участвуют в данном процессе. [6] [7] Системы, основанные на клеточных экстрактах, подвержены таким проблемам, как быстрая деградация компонентов вне их хозяина, как показано в исследовании Китаоки и др. , где система трансляции, не содержащая клеток, основанная на Escherichia coli ( E. coli ), основанная на клеточных экстрактах, имела очень быструю деградацию шаблона мРНК , что привело к остановке синтеза белка . [8]

Подготовка

Методы подготовки различаются в зависимости от ситуации в обоих типах бесклеточных систем.

На основе клеточного экстракта

Лауреат Нобелевской премии Эдуард Бухнер, возможно, был первым, кто представил бесклеточную систему с использованием дрожжевых экстрактов, но с тех пор были найдены альтернативные источники. [9] [10] E. coli , зародыши пшеницы и ретикулоциты кролика оказались полезными для создания бесклеточных систем путем извлечения их внутренних компонентов. [3] [11] Экстракты E. coli 30S были получены, например, путем измельчения бактерий с оксидом алюминия с последующей дальнейшей очисткой. [12] Аналогичным образом зародыши пшеницы измельчались с промытым кислотой песком или порошкообразным стеклом, чтобы открыть клеточные мембраны . [13] [14] Ретикулоциты кролика были лизированы в растворе MgCl 2 и экстракт был отфильтрован от мембран путем центрифугирования. [15]

Использует

Биосистемы биотрансформации бесклеточного синтетического пути предлагаются в качестве новой недорогой платформы биопроизводства по сравнению с микробной ферментацией , которая использовалась на протяжении тысяч лет. [3] [16] Бесклеточные биосистемы имеют ряд преимуществ, подходящих для промышленного применения: [6]

  • Очень высокие выходы продукта обычно достигаются без образования побочных продуктов или синтеза клеточной массы. Например, с синтетическим ферментным путем, из реакции с крахмалом и водой
C 6 H 10 O 5 (ж) + 7 H 2 O (ж) → 12 H 2 (г) + 6 CO 2 (г),
На единицу глюкозы полисахаридов и воды было получено около 12 H2 , что в три раза превышает теоретический выход лучших анаэробных микроорганизмов, продуцирующих водород . [17]
  • Биосистемы in vitro могут реализовывать некоторые биологические реакции, которые живые микробы или химические катализаторы не могли реализовать ранее. Например, связанная бета-1,4-глюкозидной связью целлюлоза может быть преобразована в связанный альфа-1,4-глюкозидной связью крахмал с помощью смеси внутриклеточных и внеклеточных ферментов в одном реакционном контейнере. [18]
  • Ферментативные системы, без барьера клеточной мембраны, обычно имеют более высокие скорости реакции , чем микробные системы. Например, ферментативные топливные элементы обычно имеют гораздо более высокую выходную мощность, чем микробные топливные элементы. [19]
  • Ферментные коктейли могут переносить токсичные соединения лучше, чем микроорганизмы. [20]
  • Смеси ферментов обычно работают в широких условиях реакции, таких как высокая температура, низкий pH , присутствие органических растворителей или ионных жидкостей . [16]

Синтез белка

Биосистемы in vitro можно легко контролировать и получать к ним доступ без мембран. [16] Примечательно, что в работе, которая привела к Нобелевской премии, эксперимент Ниренберга и Маттеи использовал бесклеточную систему типа клеточного экстракта для включения выбранных аминокислот, помеченных радиоактивно, в синтезированные белки с 30S, извлеченными из E. coli . [12] [21] Более поздние исследования, такие как исследование, проведенное Спирином и др. с прокариотической и эукариотической версией их бесклеточной системы трансляции, также синтезировали белки с повышенной производительностью, включив такие методы, как непрерывный поток для добавления материалов и удаления продуктов. [22] Благодаря таким достижениям в урожайности были расширены приложения производительности, такие как синтез белков слияния, которые потенциально могут служить вакцинами для В-клеточных лимфом . [23] Кроме того, бесклеточный синтез белка становится новым альтернативным выбором для быстрого синтеза белка. [6]

Метаболическая манипуляция

Инженерия метаболических процессов была достигнута с помощью бесклеточных систем. [24] [10] [3] Бухара и др. , например, смогли использовать экстракты гликолитической сети, состоящие из ферментов из E. coli , которые продуцируют дигидроксиацетонфосфат , для анализа в реальном времени концентраций метаболитов , изменяя при этом уровни ферментов, что привело к оптимальному производству дигидроксиацетонфосфата . [25] Кроме того, Кэлхун и Шварц смогли использовать гликолитический промежуточный продукт для питания бесклеточной системы, что позволило относительно недорого генерировать АТФ по сравнению с использованием реагентов в реакциях фосфоенолпирувата . [26]

Неестественное включение аминокислот

Бесклеточные системы также использовались для включения неестественных аминокислот . [26] [27] Шимизу и др. смогли изменить стоп-кодон на смысловой кодон , исключив фактор высвобождения RF1 , что указывает на возможность вставлять желаемые аминокислоты в неестественных ситуациях. Это полезно в системах, где работа внутри клетки проблематична, например, процесс метаболизма аминокислот, препятствующий специфической маркировке аминокислот, которая была бы полезна в многомерной ЯМР-спектроскопии . [28] Кигава и др. смогли успешно маркировать аминокислоты в бесклеточной системе, где метаболизм аминокислот больше не присутствовал, что сделало такие системы полезными для исследований ЯМР. [28]

Ссылки

  1. ^ Шварц, Джим (2006-07-01). «Разработка бесклеточной биологии для промышленных применений». Журнал промышленной микробиологии и биотехнологии . 33 (7): 476–485. doi : 10.1007/s10295-006-0127-y . ISSN  1367-5435. PMID  16761165. S2CID  12374464.
  2. ^ "Браузер MeSH". meshb.nlm.nih.gov . Получено 18 октября 2017 г.
  3. ^ abcd Gregorio, Nicole E.; Levine, Max Z.; Oza, Javin P. (2019). "Руководство пользователя по бесклеточному синтезу белка". Методы и протоколы . 2 (1): 24. doi : 10.3390/mps2010024 . PMC 6481089. PMID 31164605  . 
  4. ^ Земелла, Энн; Торинг, Лена; Хоффмайстер, Кристиан; Кубик, Стефан (2015-11-01). «Бесклеточный синтез белка: за и против прокариотических и эукариотических систем». ChemBioChem . 16 (17): 2420–2431. doi :10.1002/cbic.201500340. ISSN  1439-7633. PMC 4676933 . PMID  26478227. 
  5. ^ Лу, Юань (2017). «Бесклеточная синтетическая биология: инженерия в открытом мире». Синтетическая и системная биотехнология . 2 (1): 23–27. doi :10.1016/j.synbio.2017.02.003. PMC 5625795. PMID  29062958 . 
  6. ^ abc Роллин, Джозеф А.; Там, Цз Кин; Чжан, Й.-Х. Персиваль (2013-06-21). "Новая парадигма биотехнологии: бесклеточные биосистемы для биопроизводства". Green Chemistry . 15 (7): 1708. doi :10.1039/c3gc40625c. ISSN  1463-9270.
  7. ^ Симидзу, Ёсихиро; Иноуэ, Акио; Томари, Юкихидэ; Сузуки, Цутому; Ёкогава, Такаси; Нисикава, Казуя; Уэда, Такуя (23 мая 2001 г.). «Бесклеточный перевод, восстановленный очищенными компонентами». Природная биотехнология . 19 (8): 751–755. дои : 10.1038/90802. PMID  11479568. S2CID  22554704.
  8. ^ Китаока, Ёсихиса; Нисимура, Норихиро; Нивано, Мицуру (1996). «Кооперативность стабилизированной мРНК и повышенная трансляционная активность в бесклеточной системе». Журнал биотехнологии . 48 (1–2): 1–8. doi :10.1016/0168-1656(96)01389-2. PMID  8818268.
  9. ^ Барнетт, Джеймс А.; Лихтенталер, Фридер В. (15 марта 2001 г.). «История исследований дрожжей 3: Эмиль Фишер, Эдуард Бухнер и их современники, 1880-1900». Дрожжи . 18 (4): 363–388. doi : 10.1002/1097-0061(20010315)18:4<363::AID-YEA677>3.0.CO;2-R . ISSN  1097-0061. PMID  11223946. S2CID  2349735.
  10. ^ ab Swartz, James R. (01.01.2012). «Трансформация биохимической инженерии с помощью бесклеточной биологии». Журнал AIChE . 58 (1): 5–13. doi :10.1002/aic.13701. ISSN  1547-5905.
  11. ^ Штиге, Вольфганг; Эрдманн, Фолькер А. (1995). «Потенциал системы биосинтеза белка in vitro». Журнал биотехнологии . 41 (2–3): 81–90. doi :10.1016/0168-1656(95)00005-b. PMID  7654353.
  12. ^ ab Matthaei H.; Nirenberg (1962). "Характеристики и стабилизация синтеза белка, чувствительного к ДНКазе, в экстрактах E. coli". Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 47 (10): 1580–1588. Bibcode :1961PNAS...47.1580M. doi : 10.1073/pnas.47.10.1580 . PMC 223177 . PMID  14471391. 
  13. ^ Андерсон, Карл В.; Штраус, Дж. Уильям; Дудок, Бернард С. (1983). "[41] Приготовление бесклеточной системы синтеза белка из зародышей пшеницы". Рекомбинантная ДНК, часть C. Методы в энзимологии. Т. 101. С. 635–644. doi :10.1016/0076-6879(83)01044-7. ISBN 9780121820015. PMID  6888279.
  14. ^ Madin, Kairat; Sawasaki, Tatsuya; Ogasawara, Tomio; Endo, Yaeta (2000-01-18). «Высокоэффективная и надежная система бесклеточного синтеза белка, полученная из зародышей пшеницы: растения, по-видимому, содержат систему самоубийства, направленную на рибосомы». Труды Национальной академии наук . 97 (2): 559–564. Bibcode : 2000PNAS...97..559M. doi : 10.1073/pnas.97.2.559 . ISSN  0027-8424. PMC 15369. PMID 10639118  . 
  15. ^ Вудворд, Уильям Р.; Айви, Джоэл Л.; Герберт, Эдвард (1974). "[67a] Синтез белка с препаратами ретикулоцитов кролика". Nucleic Acids and Protein Synthesis Part F. Methods in Enzymology. Vol. 30. pp. 724–731. doi :10.1016/0076-6879(74)30069-9. ISBN 9780121818937. PMID  4853925.
  16. ^ abc YH Percival Zhang (март 2010 г.). «Производство биопродуктов и биоэлектричества путем бесклеточного синтетического ферментативного пути биотрансформации: проблемы и возможности». Биотехнология и биоинженерия . 105 (4): 663–677. doi : 10.1002/bit.22630 . PMID  19998281.
  17. ^ Zhang YH, Evans BR, Mielenz JR, Hopkins RC, Adams MW (2007). "Высокопроизводительное производство водорода из крахмала и воды синтетическим ферментативным путем". PLOS ONE . 2 (5): e456. Bibcode : 2007PLoSO...2..456Z. doi : 10.1371/journal.pone.0000456 . PMC 1866174. PMID  17520015 . 
  18. ^ You C, Chen H, Myung S, Sathitsuksanoh N, Ma H, Zhang XZ, Li J, Zhang YH (2013). «Ферментативная трансформация непищевой биомассы в крахмал». Труды Национальной академии наук . 110 (18): 7182–7187. Bibcode : 2013PNAS..110.7182Y. doi : 10.1073/pnas.1302420110 . PMC 3645547. PMID  23589840 . 
  19. ^ Zhu Z, Kin Tam T, Sun F, You C, Percival Zhang YH (2014). «Сахарная биобатарея высокой плотности на основе синтетического ферментативного пути». Nature Communications . 5 : 3026. Bibcode : 2014NatCo...5.3026Z. doi : 10.1038/ncomms4026 . hdl : 10919/87717 . PMID  24445859.
  20. ^ Ван, Иран; Хуан, Вэйдун; Сатицуксано, Ноппадон; Чжу, Чжигуан; Чжан, Й.-Х. Персиваль (2011). «Биогидрогенизация из биомассы сахара, опосредованная синтетическими ферментативными путями in vitro». Химия и биология . 18 (3): 372–380. doi : 10.1016/j.chembiol.2010.12.019 . PMID  21439482.
  21. ^ Nirenberg, MW & Matthaei, HJ (1961). «Зависимость синтеза бесклеточного белка в E. coli от встречающихся в природе или синтетических полирибонуклеотидов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 47 (10): 1588–1602. Bibcode :1961PNAS...47.1588N. doi : 10.1073/pnas.47.10.1588 . PMC 223178 . PMID  14479932. 
  22. ^ Спирин, АС; Баранов, ВИ; Рябова, ЛА; Оводов, СЮ; Алахов, ЮБ (1988-11-25). "Непрерывная бесклеточная система трансляции, способная производить полипептиды с высоким выходом". Science . 242 (4882): 1162–1164. Bibcode :1988Sci...242.1162S. doi :10.1126/science.3055301. ISSN  0036-8075. PMID  3055301.
  23. ^ Yang, Junhao; Kanter, Gregory; Voloshin, Alexei; Michel-Reydellet, Nathalie; Velkeen, Hendrik; Levy, Ronald; Swartz, James R. (2005-03-05). "Быстрая экспрессия вакцинных белков для В-клеточной лимфомы в бесклеточной системе". Biotechnology and Bioengineering . 89 (5): 503–511. doi :10.1002/bit.20283. ISSN  1097-0290. PMID  15669088.
  24. ^ Тинафар, Эйдан; Джейнес, Катариина; Парди, Кит (8 августа 2019 г.). «Синтетическая биология становится бесклеточной». BMC Biology . 17 (1): 64. doi : 10.1186/s12915-019-0685-x . PMC 6688370. PMID  31395057 . 
  25. ^ Бухара, Маттиас; Шюмперли, Михаэль; Пелло, Рене; Хайнеманн, Маттиас ; Панке, Свен (2011). «Оптимизация плана гликолиза in vitro с помощью метаболического анализа в реальном времени» (PDF) . Nature Chemical Biology . 7 (5): 271–277. doi :10.1038/nchembio.541. PMID  21423171. S2CID  6613252.
  26. ^ ab Calhoun, Kara A.; Swartz, James R. (2005-06-05). «Энергетическая активация бесклеточного синтеза белка с помощью метаболизма глюкозы». Биотехнология и биоинженерия . 90 (5): 606–613. doi : 10.1002/bit.20449 . ISSN  1097-0290. PMID  15830344.
  27. ^ Noren, CJ; Anthony-Cahill, SJ; Griffith, MC; Schultz, PG (1989-04-14). "Общий метод сайт-специфического включения неприродных аминокислот в белки". Science . 244 (4901): 182–188. Bibcode :1989Sci...244..182N. doi :10.1126/science.2649980. ISSN  0036-8075. PMID  2649980.
  28. ^ ab Кигава, Таканори; Муто, Ютака; Ёкояма, Шигеюки (1995-09-01). «Бесклеточный синтез и селективная аминокислотная маркировка стабильных изотопов белков для ЯМР-анализа». Журнал биомолекулярного ЯМР . 6 (2): 129–134. doi :10.1007/bf00211776. ISSN  0925-2738. PMID  8589601. S2CID  19080000.
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cell-free_system&oldid=1219981746"