ЯСНОСТЬ

CLARITY [1] — это метод создания прозрачной ткани с использованием гидрогелей на основе акриламида , созданных изнутри ткани и связанных с ней, и, как определено в первоначальной статье, представляет собой «трансформацию неповрежденной биологической ткани в гибридную форму, в которой определенные компоненты заменяются экзогенными элементами, которые обеспечивают новую доступность или функциональность». [1] При сочетании с маркировкой на основе антител или генов CLARITY позволяет получать высокодетализированные изображения структуры белков и нуклеиновых кислот органов, особенно мозга . Он был разработан Квангун Чунгом и Карлом Дейссеротом в Медицинской школе Стэнфордского университета . [2]

В нескольких опубликованных работах метод CLARITY применялся к широкому спектру тканей и заболеваний, таких как иммуноонкология для рака молочной железы человека, [3] болезнь Альцгеймера мозга человека, [4] спинной мозг мышей, [5] модели рассеянного склероза у животных, [6] и растения. [7] CLARITY также был объединен с другими технологиями для разработки новых методов микроскопии, включая конфокальную микроскопию расширения , микроскопию светового листа SPIM и оптимизированную для CLARITY микроскопию светового листа (COLM). [8]

Процедура

Трехмерное изображение, полученное с помощью техники CLARITY, показывающее 1-миллиметровый срез гиппокампа мыши . Разные цвета представляют белки, окрашенные флуоресцентными антителами. Возбуждающие нейроны обозначены зеленым, тормозные нейроны — красным, а астроциты — синим.

Процесс применения визуализации CLARITY начинается с посмертного образца ткани. В зависимости от типа ткани после фиксации образца могут потребоваться предварительные этапы обработки, такие как деминерализация или обесцвечивание. Затем необходимо применить ряд химических обработок для достижения прозрачности, при которых удаляется липидное содержимое образца, в то время как почти все исходные белки и нуклеиновые кислоты остаются на месте. [1] Цель этого — сделать ткань прозрачной и, таким образом, поддающейся детальному микроскопическому исследованию ее составных функциональных частей (которые в основном являются белками и нуклеиновыми кислотами). Для этого необходимо поместить уже существующую структуру белка в прозрачный каркас, который сохраняет ее, в то время как липидные компоненты удаляются. Этот «каркас» состоит из гидрогелевых мономеров, таких как акриламид. Добавление молекул, таких как формальдегид , параформальдегид или глутаральдегид, может облегчить присоединение каркаса к белкам и нуклеиновым кислотам, которые необходимо сохранить, а добавление тепла необходимо для установления фактических связей между клеточными компонентами и акриламидом. [9]

После завершения этого этапа компоненты белка и нуклеиновой кислоты клеток целевой ткани прочно удерживаются на месте, в то время как липидные компоненты остаются отсоединенными. Затем липиды удаляются в течение нескольких дней или недель для пассивной диффузии в детергенте или ускоряются электрофоретическими методами до нескольких часов или дней. [10] [11] Попытки ускорить электрофоретическими методами остаются безрезультатными с точки зрения способности не вызывать повреждения тканей. По мере прохождения липофильные свойства детергента позволяют ему захватывать и удалять любые липиды, встречающиеся на пути. Липофильные красители, такие как DiI , удаляются, однако существуют липофильные красители, совместимые с CLARITY, которые могут быть зафиксированы на соседних белках. [12] Подавляющее большинство нелипидных молекул, таких как белки и ДНК, остаются незатронутыми этой процедурой благодаря акриламидному гелю и химическим свойствам задействованных молекул. [9]

Как сообщалось в первоначальной статье, ткань расширяется во время этого процесса, но при необходимости может быть восстановлена ​​до своих первоначальных размеров с помощью заключительного этапа инкубации в растворе, соответствующем показателю преломления. [1] Расширение ткани происходит в уникально богатом липидами мозге; однако было отмечено, что другие типы тканей не испытывают такого большого расширения ткани на протяжении всего процесса.

На этом этапе процесса образец полностью подготовлен к визуализации. Контраст для визуализации может исходить от эндогенных флуоресцентных молекул, от меток нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) или от иммуноокрашивания , при котором используются антитела , которые специфически связываются с определенным целевым веществом. Кроме того, эти антитела помечены флуоресцентными метками, которые являются ключом к окончательному результату визуализации. Стандартные методы конфокальной, двухфотонной или световой визуализации подходят для последующего обнаружения флуоресценции, испускаемой вплоть до масштаба локализации белка, что приводит к получению окончательных высокодетализированных и трехмерных изображений, которые создает CLARITY. [9]

После иммуноокрашивания образца для получения изображения можно удалить антитела и повторно применить новые, что позволяет визуализировать образец несколько раз и нацеливать его на несколько типов белков. [13] [14]

Приложения

С точки зрения визуализации мозга, способность визуализации CLARITY выявлять определенные структуры в таких беспрепятственных деталях открыла многообещающие пути будущих приложений, включая локальную проводку цепей (особенно в том, что касается проекта Connectome ), взаимосвязи между нервными клетками, роли субклеточных структур, лучшее понимание белковых комплексов и визуализацию нуклеиновых кислот и нейротрансмиттеров . [1] Примером открытия, сделанного с помощью визуализации CLARITY, является своеобразная «лестничная» модель, в которой нейроны соединяются друг с другом и своими соседями, что, как было замечено у животных, связано с поведением, подобным аутизму . [15]

Метод CLARITY расширился до нескольких приложений за пределами мозга. [16] Было опубликовано множество модификаций, основанных на первоначальных публикациях, и были предприняты усилия как в академической среде, так и в биотехнологической отрасли для применения CLARITY в широком спектре приложений. CLARITY продолжает набирать обороты как новая технология, которая может обеспечить мощное понимание клинической диагностики в будущем. CLARITY можно использовать с небольшими или вообще без модификаций для очистки большинства других органов, таких как печень, поджелудочная железа, селезенка, яички и яичники, а также других видов, таких как данио-рерио. В то время как кость требует простого этапа декальцинации, растительная ткань требует ферментативного расщепления клеточной стенки. [10]

Директор NIH Фрэнсис Коллинз уже выразил свои надежды на эту новую технологию, заявив: [17]

«CLARITY — это мощный инструмент. Он позволит исследователям изучать неврологические заболевания и расстройства, сосредоточившись на больных или поврежденных структурах, не теряя при этом глобальной перспективы. Это то, чего мы никогда раньше не могли делать в трех измерениях».

—  Фрэнсис Коллинз

Ограничения

Хотя процедура CLARITY достигла беспрецедентных уровней удержания белка после экстракции липидов, эта техника все еще теряет приблизительно 8% белков за один случай электрофореза детергента. [13] Повторная визуализация одного образца только усилит эту потерю, поскольку удаление антител обычно выполняется с помощью того же процесса детергента, который создает исходный образец. [9] Однако эти расчеты, по-видимому, не имеют последовательного метода для общей потери белка на протяжении всего эксперимента. ClearLight Biotechnologies, компания, основанная Карлом Дейссеротом, обнаружила, что процесс детергента, первоначально опубликованный для удаления антител, не был идеальным подходом, и разработала раствор для обесцвечивания, который не был столь пагубным для целостности ткани.

Другие потенциальные недостатки метода — длительность создания и визуализации образца ( только иммуногистохимическое окрашивание занимает до шести недель), а также тот факт, что используемый акриламид является высокотоксичным и канцерогенным . Время часто упоминалось как ограничивающий фактор и недостаток использования метода CLARITY; однако несколько академических и биотехнологических компаний (Logos Bioscience, ClearLight Biotechnologies) продолжили разрабатывать и оптимизировать реагенты CLARITY, которые значительно сократили время иммуноокрашивания, сократив процесс с шести недель до недели в зависимости от типа образца. Все очистки тканей имеют свои собственные проблемы безопасности. Хотя акриламид считается токсичным и канцерогенным, его компоненты аналогичны тем, которые содержатся в гелях, используемых для вестерн-блоттинга.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ abcde Chung K, Wallace J, Kim SY, Kalyanasundaram S, Andalman AS, Davidson TJ, Mirzabekov JJ, Zalocusky KA, Mattis J, Denisin AK, Pak S, Bernstein H, Ramakrishnan C, Grosenick L, Gradinaru V, Deisseroth K (май 2013 г.). "Структурное и молекулярное исследование интактных биологических систем". Nature . 497 (7449): 332– 7. Bibcode :2013Natur.497..332C. doi :10.1038/nature12107. PMC  4092167 . PMID  23575631.
  2. ^ Андервуд Э. (апрель 2013 г.). «Нейронаука. Метод визуализации тканей проясняет все». Science . 340 (6129): 131– 2. doi :10.1126/science.340.6129.131. PMID  23580500.
  3. ^ Chen Y, Shen Q, White SL, Gokmen-Polar Y, Badve S, Goodman LJ (апрель 2019 г.). «Трехмерная визуализация и количественный анализ в тканях рака молочной железы, обработанных CLARITY». Scientific Reports . 9 (1): 5624. Bibcode :2019NatSR...9.5624C. doi :10.1038/s41598-019-41957-w. PMC 6449377 . PMID  30948791. 
  4. ^ Ando K, Laborde Q, Lazar A, Godefroy D, Youssef I, Amar M, Pooler A, Potier MC, Delatour B, Duyckaerts C (сентябрь 2014 г.). «Внутри мозга Альцгеймера с CLARITY: сенильные бляшки, нейрофибриллярные клубки и аксоны в 3D». Acta Neuropathologica . 128 (3): 457– 9. doi :10.1007/s00401-014-1322-y. PMC 4131133. PMID  25069432 . 
  5. ^ Zhang MD, Tortoriello G, Hsueh B, Tomer R, Ye L, Mitsios N, Borgius L, Grant G, Kiehn O, Watanabe M, Uhlén M, Mulder J, Deisseroth K, Harkany T, Hökfelt TG (март 2014 г.). «Нейрональные кальций-связывающие белки 1/2 локализуются в ганглиях задних корешков и возбуждающих спинномозговых нейронах и регулируются повреждением нервов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 111 (12): E1149-58. Bibcode : 2014PNAS..111E1149Z. doi : 10.1073/pnas.1402318111 . PMC 3970515. PMID  24616509 . 
  6. ^ Spence RD, Kurth F, Itoh N, Mongerson CR, Wailes SH, Peng MS, MacKenzie-Graham AJ (ноябрь 2014 г.). «Привнесение ЯСНОСТИ в атрофию серого вещества». NeuroImage . 101 : 625– 32. doi :10.1016/j.neuroimage.2014.07.017. PMC 4437539 . PMID  25038439. 
  7. ^ Palmer WM, Martin AP, Flynn JR, Reed SL, White RG, Furbank RT, Grof CP (сентябрь 2015 г.). "PEA-CLARITY: 3D молекулярная визуализация целых органов растений". Scientific Reports . 5 : 13492. Bibcode :2015NatSR...513492P. doi :10.1038/srep13492. PMC 4556961 . PMID  26328508. 
  8. ^ Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K (июль 2014 г.). «Advanced CLARITY для быстрой и высокоразрешающей визуализации неповрежденных тканей». Nature Protocols . 9 (7): 1682– 97. doi :10.1038/nprot.2014.123. PMC 4096681 . PMID  24945384. 
  9. ^ abcd Geaghan-Breiner C (2013). «CLARITY Brain Imaging». Стэнфордский университет.
  10. ^ ab Jensen KH, Berg RW (декабрь 2017 г.). «Достижения и перспективы очистки тканей с использованием CLARITY». Журнал химической нейроанатомии . 86 : 19–34 . doi :10.1016/j.jchemneu.2017.07.005. PMID  28728966. S2CID  27575056.
  11. ^ Lee E, Choi J, Jo Y, Kim JY, Jang YJ, Lee HM, Kim SY, Lee HJ, Cho K, Jung N, Hur EM, Jeong SJ, Moon C, Choe Y, Rhyu IJ, Kim H, Sun W (январь 2016 г.). "ACT-PRESTO: быстрый и последовательный метод очистки и маркировки тканей для трехмерной (3D) визуализации". Scientific Reports . 6 (1): 18631. Bibcode :2016NatSR...618631L. doi :10.1038/srep18631. PMC 4707495 . PMID  26750588. 
  12. ^ Jensen KH, Berg RW (сентябрь 2016 г.). «Совместимые с CLARITY липофильные красители для маркировки электродов и отслеживания нейронов». Scientific Reports . 6 : 32674. Bibcode :2016NatSR...632674J. doi :10.1038/srep32674. PMC 5011694 . PMID  27597115. 
  13. ^ ab Shen, Helen (10 апреля 2013 г.). «Прозрачные мозги проясняют связи». Nature News .
  14. ^ Murray E, Cho JH, Goodwin D, Ku T, Swaney J, Kim SY, Choi H, Park YG, Park JY, Hubbert A, McCue M, Vassallo S, Bakh N, Frosch MP, Wedeen VJ, Seung HS, Chung K (декабрь 2015 г.). «Простая масштабируемая протеомная визуализация для высокоразмерного профилирования интактных систем». Cell . 163 (6): 1500– 14. doi :10.1016/j.cell.2015.11.025. PMC 5275966 . PMID  26638076. 
  15. ^ "Прозрачные мозги". Видео о природе.
  16. ^ «Применение методов очищения тканей: CLARITY за пределами мозга».
  17. ^ Коллинз Ф. (11 апреля 2013 г.). «Мозг: сейчас вы его видите, скоро вы его не увидите». Блог директоров NIH . NIH.
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=ЯСНОСТЬ&oldid=1190665155"