Анализ разветвленной ДНК
Анализ на обнаружение нуклеиновой кислоты

В биологии анализ разветвленной ДНК представляет собой анализ усиления сигнала (в отличие от анализа усиления мишени), который используется для обнаружения молекул нуклеиновых кислот . [1]

Метод

Анализ разветвленной ДНК начинается с чашки или какой-либо другой твердой подложки (например, пластиковой щуповой палочки). Чашка усеяна небольшими одноцепочечными молекулами ДНК (или цепями), которые торчат в раствор. Они известны как молекулы ДНК-зонда захвата. Затем добавляется молекула ДНК-удлинителя. Каждый удлинитель имеет два домена: один, который гибридизируется с молекулой ДНК-удерживания, и один, который торчит над поверхностью. Цель удлинителя двоякая. Во-первых, он создает больше доступной площади поверхности для связывания молекул ДНК-мишени, а во-вторых, он позволяет легко адаптировать анализ для обнаружения различных молекул ДНК-мишени.

После того, как молекулы захвата и удлинителя будут на месте и гибридизуются, можно добавлять образец. Целевые молекулы в образце будут связываться с молекулой удлинителя. Это приводит к образованию основания, усеянного зондами захвата, которые гибридизуются с зондами удлинителя, которые, в свою очередь, гибридизуются с целевыми молекулами.

В этот момент происходит усиление сигнала. Добавляется молекула ДНК-удлинителя метки, которая имеет два домена (аналогично первому удлинителю). Удлинитель метки гибридизуется с мишенью и с предварительно амплифицированной молекулой. Молекула преусилителя имеет два домена. Во-первых, она связывается с удлинителем метки, а во-вторых, с молекулой-усилителем. Примером молекулы-усилителя является олигонуклеотидная цепь, связанная с ферментом щелочной фосфатазой .

Схематически процесс можно представить следующим образом:
База → Зонд захвата → Расширитель → Цель → расширитель метки → предварительный усилитель → усилитель.

Использование и преимущества

Анализ может быть использован для обнаружения и количественной оценки многих типов РНК или ДНК-мишеней. В анализе разветвленная ДНК смешивается с образцом для тестирования. Обнаружение выполняется с использованием нерадиоактивного метода и не требует предварительной амплификации нуклеиновой кислоты для обнаружения. Анализ полностью основан на гибридизации. Ферменты используются для указания степени гибридизации, но не используются для манипулирования нуклеиновыми кислотами. Таким образом, небольшие количества нуклеиновой кислоты могут быть обнаружены и количественно определены без этапа обратной транскрипции (в случае РНК) и/или ПЦР . Анализ может быть выполнен как высокопроизводительный анализ, в отличие от количественного нозерн-блоттинга или анализа защиты от РНКазы, которые являются трудоемкими и, следовательно, сложными для выполнения на большом количестве образцов. Другим основным высокопроизводительным методом, используемым для количественной оценки определенных молекул РНК, является количественная ПЦР после обратной транскрипции РНК в кДНК .

Несколько различных коротких одноцепочечных молекул ДНК ( олигонуклеотидов ) используются в разветвленном ДНК-анализе. Олигонуклеотид захвата и захвата-удлинителя связывается с целевой нуклеиновой кислотой и иммобилизует ее на твердом носителе. Затем олигонуклеотид-метка и разветвленная ДНК обнаруживают иммобилизованную целевую нуклеиновую кислоту. Иммобилизация мишени на твердом носителе облегчает обширную промывку, что снижает количество ложноположительных результатов. После связывания мишени с твердой основой ее можно обнаружить с помощью разветвленной ДНК, которая связана с ферментом (например, щелочной фосфатазой). Разветвленная ДНК связывается с нуклеиновой кислотой образца путем специфической гибридизации в областях, которые не заняты гибридами захвата. Ветвление ДНК обеспечивает очень плотное декорирование ДНК ферментом, что важно для высокой чувствительности анализа [ требуется ссылка ] . Фермент катализирует реакцию субстрата, который генерирует свет (обнаруживаемый в люминометре). Количество испускаемого света увеличивается с количеством специфической нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце. Конструкция разветвленной ДНК и способ ее гибридизации с исследуемой нуклеиновой кислотой различаются в разных поколениях анализа bDNA. [2] Несмотря на то, что исходный материал не предварительно амплифицируется, анализы bDNA могут обнаружить менее 100 копий ВИЧ-РНК на мл крови. [2] Недавняя публикация в Nature Scientific Reports использует уровни cfDNA в качестве предиктора эффективности химиотерапии при лечении запущенных форм рака и использует подход с разветвленной ДНК для усиления сигнала следа cfDNA. [3]

Смотрите также

Примечания и ссылки

  1. ^ Ариффин, Сити Нур Фатхила Ахмад (2013). «Разветвленная ДНК: новый метод молекулярной диагностики в исследованиях костей». Research Updates in Medical Sciences (RUMeS) . 1 (1): 27–29 .
  2. ^ ab Collins, ML; Irvine, B.; Tyner, D.; Fine, E.; Zayati, C.; Chang, C.; Horn, T.; Ahle, D.; Detmer, J.; Shen, LP; Kolberg, J.; Bushnell, S.; Urdea, MS; Ho, DD (1997). "Анализ амплификации сигнала разветвленной ДНК для количественной оценки целевых нуклеиновых кислот ниже 100 молекул/мл". Nucleic Acids Research . 25 (15): 2979– 2984. doi :10.1093/nar/25.15.2979. PMC 146852. PMID  9224596 . 
  3. ^ Чжоу, Сяожун; Ли, Чэньчэнь; Чжан, Чжао; Ли, Дэниел Ю.; Ду, Цзиньвэй; Дин, Пин; Мэн, Хайянь; Сюй, Хуэй; Ли, Ронглэй; Хо, Эффи; Чжан, Айго (2021-04-07). "Кинетика cfDNA плазмы предсказывает клинический ответ у пациентов с немелкоклеточным раком легких". Scientific Reports . 11 (1): 7633. Bibcode :2021NatSR..11.7633Z. doi :10.1038/s41598-021-85797-z. ISSN  2045-2322. PMC 8027214 . PMID  33828112. 
Получено с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Анализ_разветвленной_ДНК&oldid=1172144605"