Аллель-специфический олигонуклеотид
Короткий фрагмент синтетической ДНК

Антисмысловой олигонуклеотид ( ASO ) — это короткий фрагмент синтетической ДНК , комплементарный последовательности вариабельной целевой ДНК. Он действует как зонд на наличие цели в анализе Саузерн-блоттинга или, чаще, в более простом анализе дот-блоттинга . Это распространенный инструмент, используемый в генетическом тестировании , судебной экспертизе и молекулярно-биологических исследованиях.

ASO обычно представляет собой олигонуклеотид длиной 15–21 нуклеотидное основание . Он разработан (и используется) таким образом, что делает его специфичным только для одной версии или аллеля тестируемой ДНК. [1] Длина ASO, из какой нити он выбран, и условия, при которых он связан с целевой ДНК (и отмывается от нее), играют роль в его специфичности. Эти зонды обычно могут быть разработаны для обнаружения разницы всего в 1 основание в генетической последовательности цели, что является базовой способностью в анализе однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), важной для анализа генотипа и проекта «Геном человека» . Чтобы быть обнаруженным после связывания со своей целью, ASO должен быть помечен радиоактивной, ферментативной или флуоресцентной меткой. Технология анализа метилирования Illumina использует ASO для обнаружения разницы в одну пару оснований (цитозин против тимина) для измерения метилирования на определенном сайте CpG.

Пример

Связывание зонда «S» ASO с «S» ДНК (вверху) или «A» ДНК (внизу).

Человеческое заболевание серповидноклеточная анемия вызвано генетической мутацией в кодоне шестой аминокислоты белка крови бета-гемоглобина . Нормальная последовательность ДНК GAG кодирует аминокислоту глутамат , тогда как мутация изменяет средний аденин на тимин , что приводит к последовательности GTG (GUG в мРНК ). Эта измененная последовательность заменяет валин в конечном белке, искажая его структуру.

Для проверки наличия мутации в образце ДНК будет синтезирован зонд ASO, комплементарный измененной последовательности [2] , здесь обозначенной как «S». В качестве контроля будет синтезирован другой ASO для нормальной последовательности «A». Каждый ASO полностью комплементарен своей целевой последовательности (и будет прочно связываться), но имеет одно несовпадение с нецелевым аллелем (что приводит к более слабому взаимодействию). Первая диаграмма показывает, как зонд «S» полностью комплементарен цели «S» (вверху), но частично несовпадает с целью «A» (внизу).

Схема дот-блотов с использованием зондов ASO «A» или «S».

Сегмент генов бета-гемоглобина в образце ДНК(-ах) будет амплифицирован с помощью ПЦР, а полученные продукты будут нанесены на дублирующие опорные мембраны в виде дот-блотов . Цепи ДНК образца разделяются щелочью, и каждый зонд ASO наносится на отдельный блот. После гибридизации используется протокол промывки, который может различать полностью комплементарные и несовпадающие гибриды. Несовпадающие ASO смываются с блотов, в то время как совпадающие ASO (и их метки) остаются.

На второй диаграмме шесть образцов амплифицированной ДНК были нанесены на каждый из двух пятен. Обнаружение метки ASO, которая остается после промывки, позволяет напрямую считывать генотип образцов , каждый из которых имеет две копии гена бета-гемоглобина. Образцы 1 и 4 имеют только нормальный аллель "A", тогда как образцы 3 и 5 имеют как аллели "A", так и "S" (и, следовательно, являются гетерозиготными носителями этой рецессивной мутации ). Образцы 2 и 6 имеют только аллель "S" и могут быть затронуты заболеванием. Небольшое количество показанной "перекрестной гибридизации" является типичным и учитывается в процессе интерпретации окончательных результатов.

Альтернативы

Анализ ASO является лишь одним из методов, используемых для обнаружения генетических полиморфизмов. Прямое секвенирование ДНК используется для первоначальной характеристики мутации, но слишком трудоемко для рутинного скрининга. Более ранний метод, полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP), не требовал предварительного знания изменения последовательности, но требовал, чтобы мутация затронула сайт расщепления рестрикционного фермента . Анализ RFLP был на короткое время адаптирован для использования олигонуклеотидных зондов , [3] , но этот метод был быстро вытеснен анализом ASO амплифицированной ДНК полимеразной цепной реакции (ПЦР). Сам метод ПЦР был адаптирован для обнаружения полиморфизмов, как аллель-специфическая ПЦР . Однако простота и универсальность комбинированного метода ПЦР/ASO привели к его постоянному использованию, в том числе с нерадиоактивными метками и в формате «обратного дот-блота», где зонды ASO связаны с мембраной, а амплифицированный образец ДНК используется для гибридизации .

История

Использование синтетических олигонуклеотидов в качестве специфических зондов для вариаций генетической последовательности было впервые предложено Р. Брюсом Уоллесом, работавшим в Национальном медицинском центре City of Hope в Дуарте, Калифорния . В 1979 году Уоллес и его коллеги сообщили об использовании зондов ASO для обнаружения вариаций в одноцепочечном бактериальном вирусе [4] , а затем применили эту технику к клонированным человеческим генам. В 1983 [5] и 1985 [2] лаборатория Уоллеса сообщила об обнаружении мутации серповидноклеточной анемии в образцах цельной геномной ДНК, хотя это применение было затруднено небольшим количеством метки, которую мог нести ASO. [2]

К счастью, в 1985 году также был описан метод ПЦР, позволяющий значительно амплифицировать определенный сегмент ДНК. [3] Менее чем через год ПЦР была объединена с анализом ASO. [6] Эта комбинация решила проблему маркировки ASO, поскольку количество целевой ДНК можно было увеличить более чем в миллион раз. Кроме того, специфичность самого процесса ПЦР можно было добавить к специфичности зондов ASO, что значительно уменьшило проблему ложного связывания ASO с нецелевыми последовательностями. Эта комбинация была достаточно специфичной, чтобы ее можно было использовать в простом точечном блоте , избегая трудоемкого и неэффективного метода Саузерн-блота .

Другие применения

ASO-PCR также может использоваться для обнаружения минимального остаточного заболевания при раке крови, таком как множественная миелома . [7]

Ссылки

  1. ^ Монга, Иша; Куреши, Абид; Такур, Нишант; Гупта, Амит Кумар; Кумар, Манодж (сентябрь 2017 г.). «ASPsiRNA: Ресурс ASP-siRNA, имеющий терапевтический потенциал для генетических заболеваний человека, и алгоритм прогнозирования их ингибирующей эффективности». G3 . 7 (9): 2931– 2943. doi : 10.1534/g3.117.044024 . PMC  5592921 . PMID  28696921.
  2. ^ abc Studencki AB, Conner BJ, Impraim CC, Teplitz RL и Wallace RB «Дискриминация генов бета-A, бета-S и бета-C-глобина человека с использованием аллель-специфических олигонуклеотидных гибридизационных зондов». Am J Hum Genet т. 37(1), стр. 42–51 (1985).
  3. ^ ab Saiki, RK; Scharf S; Faloona F; Mullis KB; Horn GT; Erlich HA; Arnheim N (20 декабря 1985 г.). "Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии". Science . 230 (4732): 1350– 4. Bibcode :1985Sci...230.1350S. doi :10.1126/science.2999980. PMID  2999980. Архивировано из оригинала 19 декабря 2008 г.
  4. ^ Уоллес, Р. Б.; Шаффер, Дж.; Мерфи, Р. Ф.; Боннер, Дж.; Хиросе, Т.; Итакура, К. (1979). «Гибридизация синтетических олигодезоксирибонуклеотидов с ДНК Phi-X 174: эффект несовпадения одной пары оснований». Nucleic Acids Research . 6 (11): 3543– 3558. doi : 10.1093 /nar/6.11.3543. PMC 327955. PMID  158748. 
  5. ^ Conner BJ, Reyes AA, Morin C, Itakura K, Teplitz RL и Wallace RB «Обнаружение аллеля S-глобина серповидноклеточной бета-хромосомы путем гибридизации с синтетическими олигонуклеотидами». Proc Natl Acad Sci USA. т. 80(1), стр. 278–282 (1983).
  6. ^ Saiki RK, Bugawan TL, Horn GT, Mullis KB и Erlich HE «Анализ ферментативно амплифицированного бета-глобина и ДНК HLA-DQ с помощью аллель-специфических олигонуклеотидных зондов» Nature т. 324(6093) стр. 163–166 (1986).
  7. ^ Caers, Jo; Garderet, Laurent; Kortüm, K. Martin; O'Dwyer, Michael E.; van de Donk, Niels WCJ; Binder, Mascha; Dold, Sandra Maria; Gay, Francesca; Corre, Jill; Beguin, Yves; Ludwig, Heinz (ноябрь 2018 г.). «Рекомендации Европейской сети миеломы по инструментам для диагностики и мониторинга множественной миеломы: что использовать и когда». Haematologica . 103 (11): 1772– 1784. doi :10.3324/haematol.2018.189159. ISSN  0390-6078. PMC 6278986 . PMID  30171031. 
  • Изображение авторадиограммы ASO
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Аллель-специфический_олигонуклеотид&oldid=1246706069"