Аффинный электрофорез
Количественный принцип аффинного электрофореза, проиллюстрированный электрофорезом при pH 8,6 конканавалина А в агарозном геле, содержащем сыворотку крови (3,6 микролитра на квадратный см). Полоса обозначает 1 см. Электрофорез проводился в течение ночи при напряжении менее 10 В/см. Анализ был выполнен в начале 1970-х годов в Лаборатории белков

Аффинный электрофорез — общее название для многих аналитических методов, используемых в биохимии и биотехнологии . С помощью аффинного электрофореза можно получить как качественную, так и количественную информацию. [1] Кросс-электрофорез, первый метод аффинного электрофореза, был создан Накамурой и др. Комплексы фермент-субстрат были обнаружены с помощью кросс-электрофореза. [2] [3] [4] [5] [6] Методы включают так называемый анализ сдвига электрофоретической подвижности , электрофорез со сдвигом заряда и аффинный капиллярный электрофорез . [1] Методы основаны на изменениях в электрофоретическом паттерне молекул (в основном макромолекул ) посредством биоспецифического взаимодействия или комплексообразования . Взаимодействие или связывание молекулы, заряженной или незаряженной, обычно изменяет электрофоретические свойства молекулы. [7] [1] Мембранные белки можно идентифицировать по сдвигу подвижности, вызванному заряженным детергентом . Нуклеиновые кислоты или фрагменты нуклеиновых кислот могут быть охарактеризованы по их сродству к другим молекулам. Методы использовались для оценки констант связывания , например, в лектиновом аффинном электрофорезе или для характеристики молекул со специфическими характеристиками, такими как содержание гликанов или связывание лигандов . [1] Для ферментов и других лиганд-связывающих белков одномерный электрофорез, аналогичный противоэлектрофорезу или «ракетному иммуноэлектрофорезу» , аффинный электрофорез может использоваться в качестве альтернативного количественного определения белка. [8] Некоторые из методов похожи на аффинную хроматографию за счет использования иммобилизованных лигандов .

Виды и методы

В настоящее время ведутся исследования по разработке новых способов использования уже имеющихся знаний об аффинном электрофорезе для улучшения его функциональности и скорости, а также предпринимаются попытки усовершенствовать уже существующие методы и адаптировать их для выполнения конкретных задач.

Электрофорез в агарозном геле

пример агарозного геля после электрофореза

Тип анализа сдвига электрофоретической подвижности (AMSA), электрофорез в агарозном геле используется для разделения аминокислотных комплексов, связанных с белками, от свободных аминокислот. Используя низкое напряжение (~10 В/см) для минимизации риска теплового повреждения, электричество пропускают через агарозный гель. При растворении в горячем буферном растворе (от 50 до 55 градусов Цельсия) он образует вязкий раствор, но при охлаждении он затвердевает в виде геля. Сывороточные белки, гемоглобин, нуклеиновые кислоты, продукты полимеразной цепной реакции и т. д. разделяются с помощью этого метода. Фиксированные сульфатные группы агарозы могут вызывать повышенный электроэндосмос, что снижает разрешение полосы. Использование сверхчистого агарозного геля с небольшим содержанием сульфата может остановить это. [ необходима цитата ]

Быстрый электрофорез в агарозном геле

В этой технике используется высокое напряжение ( ≥ 20 В/см ) с 0,5× трис-боратным буфером, проходящим через агарозный гель. [9] Этот метод отличается от традиционного электрофореза в агарозном геле использованием более высокого напряжения для обеспечения более короткого времени работы, а также получения более высокого разрешения полосы. Другими факторами, включенными в разработку техники быстрого электрофореза в агарозном геле, являются толщина геля и процент агарозы в геле.

Электрофорез с аффинностью к боронату

Электрофорез с аффинностью бороната использует акриламидные гели, пропитанные бороновой кислотой, для очистки НАД-РНК. Эта очистка позволяет исследователям легко измерять кинетическую активность ферментов декеппингования НАД-РНК. [10]

Аффинный капиллярный электрофорез

Аффинный капиллярный электрофорез (ACE) относится к ряду методов, которые основаны на специфических и неспецифических связывающих взаимодействиях для облегчения разделения и обнаружения с помощью формулярного подхода в соответствии с теорией электромиграции . [11] [12] Используя межмолекулярные взаимодействия между молекулами, происходящими в свободном растворе или мобилизованными на твердом носителе, ACE позволяет разделять и количественно определять концентрации аналитов, а также константы связывания и диссоциации между молекулами. [13] [14] В качестве аффинных зондов в CAE используются меченые флуорофором соединения со сродством к целевым молекулам. [15] С помощью ACE ученые надеются разработать сильно связывающие лекарственные препараты, понять и измерить ферментативную активность и охарактеризовать заряды на белках. [16] Аффинный капиллярный электрофорез можно разделить на три отдельных метода: неравновесный электрофорез уравновешенных смесей образцов, динамический равновесный ACE и ACE на основе сродства. [13]

Неравновесный электрофорез уравновешенных смесей образцов обычно используется при разделении и изучении связывающих взаимодействий крупных белков и включает объединение как аналита, так и его рецепторной молекулы в предварительно смешанном образце.

Эти молекулы рецепторов часто принимают форму аффинных зондов, состоящих из молекул, меченых флуорофором, которые будут связываться с целевыми молекулами, которые смешиваются с тестируемым образцом. [13] Эта смесь и ее последующие комплексы затем разделяются посредством капиллярного электрофореза. [13] Поскольку исходная смесь аналита и молекулы рецептора были связаны вместе в равновесии, медленная диссоциация этих двух связанных молекул во время электрофоретического эксперимента приведет к их разделению и последующему сдвигу равновесия в сторону дальнейшей диссоциации. [17] Характерный рисунок размазывания, полученный при медленном высвобождении аналита из комплекса во время эксперимента, можно использовать для расчета константы диссоциации комплекса. [17]

Динамическое равновесие ACE включает комбинацию аналита, обнаруженного в образце, и его рецепторной молекулы, обнаруженной в буферном растворе в капиллярной трубке, так что связывание и разделение происходят только в приборе. [13] Для динамического равновесного аффинного капиллярного электрофореза предполагается, что связывание лиганда с рецептором происходит быстро, когда аналит и буфер смешиваются. Константы связывания обычно выводятся из этого метода на основе пикового сдвига миграции рецептора, который зависит от концентрации аналита в образце. [13]

Капиллярный электрофорез на основе аффинности, также известный как капиллярная электроаффинная хроматография (CEC), включает связывание аналита в образце с иммобилизованной молекулой рецептора на стенке капилляра, микрошариками или микроканалами. [18] CEC обеспечивает самую высокую эффективность разделения из всех трех методов ACE, поскольку нематричные компоненты образца вымываются, а лиганд затем высвобождается и анализируется. [13]  

Аффинный капиллярный электрофорез использует преимущества капиллярного электрофореза и применяет их для изучения взаимодействия белков. [16] ACE выгоден тем, что имеет высокую эффективность разделения, более короткое время анализа, может работать при физиологическом pH и предполагает низкий расход лиганда/молекул. [19] [20] Кроме того, для проведения исследований ACE не обязательно знать состав интересующего белка. [16] Однако основным недостатком является то, что он не дает много стехиометрической информации об изучаемой реакции. [20]

Электрофорез в полиакриламидном геле с аффинной ловушкой

Электрофорез в полиакриламидном геле с аффинной ловушкой (PAGE) стал одним из самых популярных методов разделения белков. Это связано не только с его разделительными качествами, но и с тем, что его можно использовать в сочетании с другими аналитическими методами, такими как масс-спектрометрия и вестерн-блоттинг. [14] Помимо помощи в выделении и очистке белков из биологических образцов, AT-PAGE, как ожидается, будет полезен при анализе изменений в экспрессии определенных белков, а также при исследовании посттрансляционных модификаций белков. [21] Этот метод использует двухэтапный подход. Сначала образец белка пропускают через полиакриламидный гель с использованием электрофореза. Затем образец переносят в другой полиакриламидный гель (гель с аффинной ловушкой), где иммобилизованы аффинные зонды. Белки, не имеющие сродства к зондам сродства, проходят через гель сродства, а белки с сродством к зондам будут «захвачены» неподвижными зондами сродства. Затем эти захваченные белки визуализируются и идентифицируются с помощью масс-спектрометрии после переваривания в геле. [14]

Электрофорез сродства к фосфату

Электрофорез с аффинностью к фосфату использует аффинный зонд, который состоит из молекулы, которая специфически связывается с двухвалентными фосфатными ионами в нейтральном водном растворе, известной как «Phos-Tag». Этот метод также использует разделительный гель, изготовленный из мономера Phos-Tag с акриламидом, который сополимеризован. Фосфорилированные белки мигрируют в геле медленно по сравнению с нефосфорилированными белками. Этот метод дает исследователю возможность наблюдать различия в состояниях фосфорилирования любого данного белка. [14] Этот метод позволяет обнаруживать отдельные полосы даже в молекулах белка, которые имеют одинаковое количество фосфорилированных аминокислотных остатков, но фосфорилируются в разных местах аминокислот. [22] [23]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ abcd Киносита, Эйдзи; Киносита-Кикута, Эмико; Коике, Тору (2015-03-18). «Передовая кромка технологии аффинного электрофореза». Proteomes . 3 (1): 42–55. doi : 10.3390/proteomes3010042 . ISSN  2227-7382. PMC  5302491. PMID  28248262 .
  2. ^ Накамура, С.; Такео, К.; Сасаки, И.; Мурата, М. (август 1959 г.). «Доказательство образования комплекса фермент-субстрат с помощью электрофореза на перекрестной бумаге». Nature . 184 (4686): 638–639. Bibcode :1959Natur.184..638N. doi :10.1038/184638a0. ISSN  0028-0836. PMID  14425900. S2CID  4215250.
  3. ^ Накамура, С.; Такео, К.; Сасаки, И. (январь 1962 г.). «Nachweis von Enzym-Substrat-Komplexen durch Kreuzungselektrophorese». Zeitschrift für физиологической химии Хоппе-Зейлера . 328 (Яресбанд): 139–144. дои : 10.1515/bchm2.1962.328.1.139. ISSN  0018-4888. ПМИД  14478156.
  4. ^ Накамура, Сёдзиро; Такео, Казусукэ; Сасаки, Иване (январь 1963 г.). «Nachweis von Enzym-Substrat-Komplexen быть неактивным или неактивным ферментом». Zeitschrift für физиологической химии Хоппе-Зейлера . 334 (Яресбанд): 95–102. дои : 10.1515/bchm2.1963.334.1.95. ISSN  0018-4888. ПМИД  14136727.
  5. ^ Такео, Казусукэ; Накамура, Сёдзиро (ноябрь 1972 г.). «Константы диссоциации глюканфосфорилаз тканей кролика, изученные с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле». Архивы биохимии и биофизики . 153 (1): 1–7. doi :10.1016/0003-9861(72)90413-4. PMID  4119570.
  6. ^ Такео, Казусукэ; Нитта, Казуко; Накамура, Сёдзиро (ноябрь 1974 г.). «Демонстрация фосфорилазы в моче с помощью дискового электрофореза в полиакриламидном геле». Клиника Химика Акта . 57 (1): 45–54. дои : 10.1016/0009-8981(74)90176-4. ПМИД  4430142.
  7. ^ Айзпуруа-Олайзола, Ойер; Састре Торано, Хавьер; Пукин, Алексей; Фу, Оу; Бунс, Герт Ян; де Йонг, Герхардус Дж.; Питерс, Роланд Дж. (январь 2018 г.). «Аффинный капиллярный электрофорез для оценки аффинности связывания ингибиторов холерного токсина на основе углеводов». Электрофорез . 39 (2): 344–347. дои : 10.1002/elps.201700207. hdl : 1874/362143 . PMID  28905402. S2CID  33657660.
  8. ^ Deeb, Sami El; Wätzig, Hermann; El-Hady, Deia Abd (июль 2013 г.). «Капиллярный электрофорез для исследования биофармацевтических препаратов и фармацевтически значимых свойств связывания». TrAC Trends in Analytical Chemistry . 48 : 112–131. doi :10.1016/j.trac.2013.04.005.
  9. ^ Ream JA, Lewis LK, Lewis KA (октябрь 2016 г.). «Быстрый анализ изменения электрофоретической подвижности в агарозном геле для количественного определения белка: взаимодействия РНК». Аналитическая биохимия . 511 : 36–41. doi : 10.1016/j.ab.2016.07.027. PMC 5002362. PMID  27495142 . 
  10. ^ «Боронатный аффинный электрофорез для очистки и анализа РНК, модифицированной кофактором». Институт фармацевтики и молекулярной биотехнологии, Гейдельбергский университет, 69120 Гейдельберг, Германия .
  11. ^ Dubský P, Dvořák M, Ansorge M (2016). «Аффинный капиллярный электрофорез: теория электромиграции». Аналитическая и биоаналитическая химия . 408 (30): 8623–8641. doi :10.1007/s00216-016-9799-y. PMID  27558099. S2CID  31146155.
  12. ^ Штутц, Ханно (январь 2023 г.). «Достижения и применение методов капиллярной электромиграции в анализе терапевтических и диагностических рекомбинантных белков – Обзор». Журнал фармацевтического и биомедицинского анализа . 222 : 115089. doi : 10.1016/j.jpba.2022.115089 . PMID  36279846. S2CID  252675814.
  13. ^ abcdefg Хегаард, Нильс Х. Х.; Нильссон, Стаффан; Гузман, Норберто А. (1998-09-11). "Аффинный капиллярный электрофорез: важные области применения и некоторые недавние разработки". Журнал хроматографии B: Биомедицинские науки и приложения . 715 (1): 29–54. doi :10.1016/S0378-4347(98)00258-8. ISSN  0378-4347. PMID  9792496.
  14. ^ abcd Киносита, Эйдзи; Киносита-Кикута, Эмико; Коике, Тору (2015-03-18). «Передовая кромка технологии аффинного электрофореза». Proteomes . 3 (1): 42–55. doi : 10.3390/proteomes3010042 . PMC 5302491. PMID  28248262 . 
  15. ^ Шимура, Киёхито.; Каргер, Барри Л. (1994-01-01). "Аффинный зондовый капиллярный электрофорез: анализ рекомбинантного человеческого гормона роста с флуоресцентно меченым фрагментом антитела". Аналитическая химия . 66 (1): 9–15. doi :10.1021/ac00073a004. ISSN  0003-2700. PMID  8116876.
  16. ^ abc Чу, Йен-Хо; Авила, Луис З.; Гао, Цзиньмин; Уайтсайдс, Джордж М. (ноябрь 1995 г.). «Аффинный капиллярный электрофорез». Отчеты о химических исследованиях . 28 (11): 461–468. дои : 10.1021/ar00059a004. ISSN  0001-4842.
  17. ^ ab Крылов, Сергей Н. (2006). «Неравновесный капиллярный электрофорез равновесных смесей (NECEEM): новый метод биомолекулярного скрининга». Журнал биомолекулярного скрининга . 11 (2): 115–122. doi : 10.1177/1087057105284339 . ISSN  1087-0571. PMID  16418314.
  18. ^ Dinges, Meredith M.; Solakyildirim, Kemal; Larive, Cynthia K. (май 2014 г.). «Аффинный капиллярный электрофорез для определения сродства связывания низкомолекулярных гепаринов и антитромбина-III: CE и CEC». Электрофорез . 35 (10): 1469–1477. doi :10.1002/elps.201300549. PMID  24616065. S2CID  20484201.
  19. ^ Юй, Фанчжи; Чжао, Цян; Чжан, Дапэн; Юань, Чжэн; Ван, Хайлинь (2019-01-02). «Аффинные взаимодействия с помощью капиллярного электрофореза: связывание, разделение и обнаружение». Аналитическая химия . 91 (1): 372–387. doi :10.1021/acs.analchem.8b04741. ISSN  0003-2700. PMID  30392351. S2CID  53217680.
  20. ^ ab "Аффинный капиллярный электрофорез | MyBioSource Learning Center". Mybiosource Learning Center . Получено 2019-12-13 .
  21. ^ Авада, Тихиро; Сато, Такаши; Такао, Тошифуми (2010-01-15). «Электрофорез в полиакриламидном геле с аффинной ловушкой: новый метод захвата специфических белков с помощью электропереноса». Аналитическая химия . 82 (2): 755–761. doi :10.1021/ac902290q. ISSN  0003-2700. PMID  20038085.
  22. ^ Киносита, Эйдзи; Киносита-Кикута, Эмико; Мацубара, Мамору; Аоки, Юрий; Охие, Сиори; Мори, Юка; Коике, Тору (февраль 2009 г.). «Двумерный фосфатно-аффинный гель-электрофорез для анализа изотипов фосфопротеинов». Электрофорез . 30 (3): 550–559. doi : 10.1002/elps.200800386 . PMID  19156764. S2CID  39358740.
  23. ^ Киносита, Эйдзи; Киносита-Кикута, Эмико; Мацубара, Мамору; Ямада, Сейдзи; Накамура, Хиро; Сиро, Ёсицугу; Аоки, Юрий; Окита, Коуки; Коике, Тору (август 2008 г.). «Разделение изотипов фосфопротеинов, имеющих одинаковое количество фосфатных групп, с использованием фосфат-аффинного SDS-PAGE». Протеомика . 8 (15): 2994–3003. doi :10.1002/pmic.200800243. PMID  18615432. S2CID  32263510.
  • Подробные тексты под редакцией Нильса Х. Аксельсена в Scandinavian Journal of Immunology, 1975 Том 4 Приложение
Взято с "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Аффинный_электрофорез&oldid=1217834389"