Генная терапия сетчатки имеет перспективы в лечении различных форм ненаследственной и наследственной слепоты .
В 2008 году три независимые исследовательские группы сообщили, что пациенты с редким генетическим заболеванием сетчатки врожденным амаврозом Лебера были успешно вылечены с помощью генной терапии с аденоассоциированным вирусом (AAV). [1] [2] [3] Во всех трех исследованиях вектор AAV использовался для доставки функциональной копии гена RPE65, что восстановило зрение у детей, страдающих LCA. Эти результаты были широко расценены как успех в области генной терапии и вызвали волнение и импульс для применения AAV-опосредованных приложений при заболеваниях сетчатки.
В ретинальной генной терапии наиболее широко используемые векторы для доставки глазных генов основаны на аденоассоциированном вирусе . Большим преимуществом использования аденоассоциированного вируса для генной терапии является то, что он вызывает минимальные иммунные реакции и опосредует долгосрочную экспрессию трансгена в различных типах ретинальных клеток. Например, плотные соединения, которые образуют гемато-ретиноевый барьер, отделяют субретинальное пространство от кровоснабжения , обеспечивая защиту от микробов и уменьшая большинство иммуноопосредованных повреждений. [4]
Все еще не хватает знаний о дистрофиях сетчатки. Для улучшения знаний необходима подробная характеристика. Для решения этой проблемы создание реестров является попыткой сгруппировать и охарактеризовать редкие заболевания. Реестры помогают локализовать и измерить все фенотипы этих состояний и, следовательно, обеспечить легкое последующее наблюдение и предоставить источник информации для научного сообщества. Дизайн реестров различается от региона к региону, однако локализация и характеристика фенотипа являются золотым стандартом. Примеры реестров: RetMxMap<ARVO 2009>. Мексиканский и латиноамериканский реестр, созданный с 2009 года. Этот реестр был создан доктором Аддой Лизбет Вильянуэвой Авилес. Она является клиническим ученым, картирующим гены наследственных дистрофий сетчатки в Мексике и других латинских странах.
Доклинические исследования на мышиных моделях врожденного амавроза Лебера (LCA) были опубликованы в 1996 году, а исследование на собаках — в 2001 году. В 2008 году три группы сообщили о результатах клинических испытаний с использованием аденоассоциированного вируса для LCA. В этих исследованиях вектор AAV, кодирующий ген RPE65 , был доставлен с помощью «субретинальной инъекции», когда небольшое количество жидкости вводится под сетчатку в ходе короткой хирургической процедуры. [5] Разработка продолжалась, и в декабре 2017 года FDA одобрило Voretigene neparvovec (Luxturna), генную терапию на основе аденоассоциированного вирусного вектора для детей и взрослых с биаллельными мутациями гена RPE65, ответственными за дистрофию сетчатки, включая врожденный амавроз Лебера. У людей должны быть жизнеспособные клетки сетчатки в качестве предварительного условия для внутриглазного введения препарата. [6]
После успешных клинических испытаний в LCA исследователи разрабатывают аналогичные методы лечения с использованием аденоассоциированного вируса для возрастной макулярной дегенерации (AMD). На сегодняшний день усилия были сосредоточены на долгосрочной доставке ингибиторов VEGF для лечения влажной формы макулярной дегенерации. В то время как влажная AMD в настоящее время лечится с помощью частых инъекций рекомбинантного белка в глазное яблоко, целью этих методов лечения является долгосрочное управление заболеванием после однократного введения. Одно из таких исследований проводится в Институте Lions Eye в Австралии [7] в сотрудничестве с Avalanche Biotechnologies, биотехнологическим стартапом из США. Другое раннее исследование спонсируется корпорацией Genzyme . [8]
Ixoberogene soroparvovec (Ixo-vec) — это исследуемое интравитреальное генное терапевтическое лечение, направленное на влажную возрастную макулярную дегенерацию (AMD), целью которого является снижение бремени лечения за счет снижения частоты инъекций анти-VEGF. [9] Вводимый в виде однократной интравитреальной инъекции, Ixo-vec обеспечивает пролонгированное высвобождение афлиберцепта, анти-VEGF белка, который помогает контролировать аномальный рост кровеносных сосудов и утечку жидкости, которые являются ключевыми в прогрессировании AMD. [10] Результаты испытаний OPTIC и LUNA демонстрируют эффективность Ixo-vec в значительном снижении потребности в регулярных инъекциях в течение длительных периодов. Пациенты в этих испытаниях испытали снижение частоты инъекций на целых 90%, при этом многие оставались без инъекций в течение длительных периодов. Острота зрения оставалась стабильной, и были достигнуты анатомические результаты, такие как уменьшение толщины центрального подполя (CST). [11] Наиболее распространенным побочным эффектом было легкое внутриглазное воспаление, а профилактика стероидами оказалась эффективной в лечении этой проблемы. Этот подход к лечению, если он будет доказан в дальнейших исследованиях, может предложить пациентам с ВМД более удобную и длительную альтернативу частым инъекциям анти-VEGF, что улучшит качество жизни и приверженность лечению.
В октябре 2011 года было объявлено о первом клиническом испытании по лечению хороидеремии . [12] Доктор Роберт Макларен из Оксфордского университета, который руководил испытанием, совместно разработал лечение с доктором Мигелем Сиброй из Имперского колледжа в Лондоне. Это исследование фазы 1/2 использовало субретинальный AAV для восстановления гена REP у затронутых пациентов. [13] Первоначальные результаты испытания были сообщены в январе 2014 года как многообещающие, поскольку у всех шести пациентов улучшилось зрение. [14] [15]
Недавние исследования показали, что AAV может успешно восстанавливать цветовое зрение для лечения дальтонизма у взрослых обезьян. [16] Хотя это лечение еще не прошло клинические испытания на людях, эта работа считается прорывом в способности воздействовать на колбочковые фоторецепторы. [17]
Нейронная сетчатка позвоночных состоит из нескольких слоев и различных типов клеток (см. анатомия сетчатки человека ). Ряд этих типов клеток вовлечены в заболевания сетчатки, включая ганглиозные клетки сетчатки , которые дегенерируют при глаукоме, палочковые и колбочковые фоторецепторы , которые реагируют на свет и дегенерируют при пигментном ретините , дегенерации желтого пятна и других заболеваниях сетчатки, а также пигментный эпителий сетчатки (RPE), который поддерживает фоторецепторы и также вовлечен в пигментный ретинит и дегенерацию желтого пятна .
В ретинальной генной терапии AAV способен «трансдуцировать» эти различные типы клеток, проникая в клетки и экспрессируя терапевтическую последовательность ДНК. Поскольку клетки сетчатки не делятся, AAV продолжает сохраняться и обеспечивать экспрессию терапевтической последовательности ДНК в течение длительного периода времени, который может длиться несколько лет. [18]
AAV способен трансдуцировать несколько типов клеток в сетчатке. AAV серотипа 2, наиболее хорошо изученный тип AAV, обычно вводится одним из двух способов: интравитреально или субретинально. При интравитреальном способе AAV вводится в стекловидное тело глаза. При субретинальном способе AAV вводится под сетчатку, используя потенциальное пространство между фоторецепторами и слоем RPE, в ходе короткой хирургической процедуры. Хотя это более инвазивно, чем интравитреальный способ, жидкость поглощается RPE, и сетчатка уплощается менее чем за 14 часов без осложнений. [1] Интравитреальный AAV нацелен на ганглиозные клетки сетчатки и несколько глиальных клеток Мюллера. Субретинальный AAV эффективно нацелен на фоторецепторы и клетки RPE. [19] [20]
Причина, по которой различные пути введения приводят к трансфекции различных типов клеток (например, разный тропизм ), заключается в том, что внутренняя пограничная мембрана (ILM) и различные слои сетчатки действуют как физические барьеры для доставки лекарств и векторов в более глубокие слои сетчатки. [21] Таким образом, в целом субретинальный AAV в 5–10 раз эффективнее доставки с использованием интравитреального пути.
Одним из важных факторов доставки генов является разработка измененных клеточных тропизмов для сужения или расширения доставки генов, опосредованной rAAV, и для повышения ее эффективности в тканях. Конкретные свойства, такие как конформация капсида, стратегии нацеливания на клетки, могут определять, какие типы клеток затронуты, а также эффективность процесса переноса генов . Могут быть предприняты различные виды модификации. Например, модификация путем химических, иммунологических или генетических изменений, которая позволяет капсиду AAV2 взаимодействовать с определенными молекулами клеточной поверхности . [22]
Первоначальные исследования с AAV в сетчатке использовали AAV серотипа 2. В настоящее время исследователи начинают разрабатывать новые варианты AAV на основе естественных серотипов AAV и сконструированных вариантов AAV. [23]
Было выделено несколько естественных серотипов AAV, которые могут трансдуцировать ретинальные клетки. После интравитреальной инъекции только серотипы AAV 2 и 8 были способны трансдуцировать ретинальные ганглиозные клетки. Иногда клетки Мюллера трансдуцировались серотипами AAV 2, 8 и 9. После субретинальной инъекции серотипы 2, 5, 7 и 8 эффективно трансдуцировали фоторецепторы, а серотипы 1, 2, 5, 7, 8 и 9 эффективно трансдуцировали клетки RPE. [20]
Недавно был описан один пример сконструированного варианта, который эффективно трансдуцирует глию Мюллера после интравитреальной инъекции и использовался для спасения модели животного с агрессивным, аутосомно-доминантным пигментным ретинитом . [24] [25]
Важно отметить, что сетчатка является иммунно-привилегированной и, таким образом, не испытывает значительного воспаления или иммунного ответа при инъекции AAV. [26] Иммунный ответ на векторы генной терапии — это то, что привело к неудаче предыдущих попыток генной терапии, и считается ключевым преимуществом генной терапии в глазу. Повторное введение было успешным у крупных животных, что указывает на то, что не происходит длительного иммунного ответа. [27]
Последние данные указывают на то, что субретинальный путь может быть подвержен большей степени иммунной привилегии по сравнению с интравитреальным путем. [28]
Экспрессия в различных типах клеток сетчатки может быть определена последовательностью промотора. Чтобы ограничить экспрессию определенным типом клеток, можно использовать тканеспецифичный или клеточно-специфичный промотор.
Например, у крыс ген родопсина мыши управляет экспрессией в AAV2, репортерный продукт GFP был обнаружен только в фоторецепторах крысы, а не в других типах клеток сетчатки или в прилегающем RPE после субретинальной инъекции. С другой стороны, если повсеместно экспрессируемый немедленно-ранний энхансер-промотор цитомегаловируса (CMV) экспрессируется в широком спектре трансфицированных типов клеток. Другие вездесущие промоторы, такие как промотор CBA, слияние промотора актина цыпленка и немедленно-раннего энхансера CMV, обеспечивает стабильную экспрессию репортера GFP как в RPE, так и в фоторецепторных клетках после субретинальных инъекций. [29]
Иногда может быть необходима модуляция экспрессии трансгена, поскольку сильная конститутивная экспрессия терапевтического гена в тканях сетчатки может быть пагубной для долгосрочной функции сетчатки. Для модуляции экспрессии использовались различные методы. Одним из способов является использование экзогенно регулируемой системы промотора в векторах AAV. Например, система экспрессии, индуцируемая тетрациклином , использует вектор сайленсера/трансактиватора AAV2 и отдельную индуцируемую доксициклин-чувствительную коинъекцию. [29] [30] Когда индукция происходит с помощью перорального доксициклина , эта система демонстрирует жесткую регуляцию экспрессии гена как в фоторецепторных, так и в клетках RPE.
Одно исследование, проведенное Королевским колледжем хирургов (RCS) на крысиной модели, показывает, что рецессивная мутация в гене рецепторной тирозинкиназы, mertk, приводит к преждевременному стоп- кодону и нарушению функции фагоцитоза клетками RPE. Эта мутация вызывает накопление детрита внешнего сегмента в субретинальном пространстве, что вызывает гибель фоторецепторных клеток . Модельный организм с этим заболеванием получил субретинальную инъекцию AAV серотипа 2, несущего мышиную Mertk cDNA под контролем либо промоторов CMV, либо RPE65. Было обнаружено, что это лечение продлевает выживаемость фоторецепторных клеток на несколько месяцев [31] , а также количество фоторецепторов было в 2,5 раза выше в глазах, обработанных AAV-Mertk, по сравнению с контрольной группой через 9 недель после инъекции, также они обнаружили снижение количества детрита в субретинальном пространстве.
Белок RPE65 используется в ретиноидном цикле, где полностью транс-ретинол внутри внешнего сегмента стержня изомеризуется в свою 11-цис-форму и окисляется до 11-цис-ретиналя, прежде чем он вернется к фоторецептору и присоединится к молекуле опсина , образуя функциональный родопсин . [32] В модели нокаута животных (RPE65-/-) эксперимент по переносу генов показывает, что ранняя внутриглазная доставка вектора человеческого RPE65 на 14-й день эмбрионального развития показывает эффективную трансдукцию ретинального пигментного эпителия у мышей с нокаутом RPE65-/- и спасает зрительные функции. Это показывает, что успешная генная терапия может быть отнесена к ранней внутриглазной доставке больному животному.
Ювенильный ретиношизис — это заболевание, которое поражает нервную ткань глаза. Это заболевание является сцепленным с Х-хромосомой рецессивным дегенеративным заболеванием центральной области макулы и вызывается мутацией в гене RSI, кодирующем белок ретиношизин. Ретиношизин вырабатывается в фоторецепторных и биполярных клетках и имеет решающее значение для поддержания синаптической целостности сетчатки. [29]
В частности, вектор AAV 5, содержащий дикий тип человеческой RSI cDNA, управляемый мышиным опсиновым промоутером, показал долгосрочное функциональное и структурное восстановление сетчатки. Также структурная надежность сетчатки значительно улучшилась после лечения, характеризуясь увеличением толщины внешнего ядерного слоя . [29]
Пигментный ретинит — это наследственное заболевание, которое приводит к прогрессирующей ночной слепоте и потере периферического зрения в результате гибели фоторецепторных клеток. [29] [33] [34] Большинство людей, страдающих РП, рождаются с палочковидными клетками , которые либо мертвы, либо дисфункциональны, поэтому они фактически слепы ночью, так как эти клетки отвечают за зрение при низком уровне освещенности. За этим часто следует гибель колбочек , отвечающих за цветовое зрение и остроту зрения, при уровнях освещенности, присутствующих в течение дня. Потеря колбочек приводит к полной слепоте уже в возрасте пяти лет, но может не проявиться в течение многих лет. Было выдвинуто несколько гипотез о том, как отсутствие палочковидных клеток может привести к гибели колбочек. Точно определить механизм РП сложно, поскольку существует более 39 генетических локусов и генов, коррелирующих с этим заболеванием. В попытке найти причину РП были применены различные методы генной терапии для решения каждой из гипотез. [35]
Различные типы наследования могут быть связаны с этим заболеванием: аутосомно-рецессивный, аутосомно-доминантный, сцепленный с Х-хромосомой тип и т. д. Основная функция родопсина — инициирование каскада фототрансдукции . Белки опсина производятся во внутренних сегментах фоторецепторов, затем транспортируются во внешний сегмент и в конечном итоге фагоцитируются клетками РПЭ. Когда в родопсине происходят мутации, направленное движение белка нарушается, поскольку мутации могут влиять на сворачивание белка , стабильность и внутриклеточный трафик. Одним из подходов является введение рибозимов, доставляемых AAV, предназначенных для нацеливания и уничтожения мутантной мРНК. [29]
То, как работает эта система, было показано на модели животных, имеющих мутантный ген родопсина. Инъецированные AAV-рибозимы были оптимизированы in vitro и использованы для расщепления мутантного транскрипта мРНК P23H (где происходит большинство мутаций) in vivo. [29]
Другая мутация в структурном белке родопсина, в частности периферин 2, который является мембранным гликопротеином, участвующим в формировании диска внешнего сегмента фоторецептора, может привести к рецессивному РП и дегенерации желтого пятна у человека [33] (19). В эксперименте на мышах AAV2, несущий ген периферина 2 дикого типа, управляемый промотором родопсина, был введен мышам путем субретинальной инъекции. Результат показал улучшение структуры и функции фоторецептора, которое было обнаружено с помощью ЭРГ (электроретинограммы). Результат показал улучшение структуры и функции фоторецептора, которое было обнаружено с помощью ЭРГ. Также периферин 2 был обнаружен в слое внешнего сегмента сетчатки через 2 недели после инъекции, а терапевтические эффекты были отмечены уже через 3 недели после инъекции. Четко определенный внешний сегмент, содержащий как периферин 2, так и родопсин, присутствовал через 9 месяцев после инъекции. [29]
Так как апоптоз может быть причиной гибели фоторецепторов при большинстве дистрофий сетчатки. Известно, что факторы выживания и антиапоптозные реагенты могут быть альтернативным лечением, если мутация неизвестна для заместительной генной терапии. Некоторые ученые экспериментировали с лечением этой проблемы путем инъекции замещающих трофических факторов в глаз. Одна группа исследователей вводила белок фактора жизнеспособности колбочек, полученный из палочек (RdCVF) (кодируемый геном Nxnl1 (Txnl6)) в глаз наиболее часто встречающихся моделей крыс с доминирующей мутацией RP. Это лечение продемонстрировало успех в содействии выживанию активности колбочек, но лечение еще более существенно предотвратило прогрессирование заболевания за счет увеличения фактической функции колбочек. [36] Также были проведены эксперименты для изучения того, может ли поставка векторов AAV2 с кДНК для нейротрофического фактора, полученного из глиальной клеточной линии (GDNF), оказывать антиапоптозное действие на клетки палочек . [29] [37] При рассмотрении модели животного, трансген опсина содержит укороченный белок, в котором отсутствуют последние 15 аминокислот C-конца, что вызывает изменение в транспорте родопсина к внешнему сегменту и приводит к дегенерации сетчатки. [29] Когда вектор AAV2-CBA-GDNF вводится в субретинальное пространство, фоторецепторы стабилизируются, а палочковые фоторецепторы увеличиваются, и это было видно по улучшенной функции анализа ERG. [37] Успешные эксперименты на животных также были проведены с использованием цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), и в настоящее время CNTF используется в качестве лечения в клинических испытаниях на людях. [38]
Глазная неоваскуляризация (НВ) — это аномальное образование новых капилляров из уже существующих кровеносных сосудов в глазу, и это характерно для глазных заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия (ДР), ретинопатия недоношенных (РН) и (влажная форма) возрастной макулярной дегенерации (ВМД). Одним из главных игроков в этих заболеваниях является VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), который, как известно, вызывает утечку сосудов и который также известен как ангиогенный. [29] В нормальных тканях VEGF стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток дозозависимым образом, но такая активность теряется при наличии других ангиогенных факторов. [39]
Было показано, что многие ангиостатические факторы противодействуют эффекту увеличения локального VEGF. Было показано, что естественная форма растворимого Flt-1 обращает неоваскуляризацию у крыс, мышей и обезьян. [40] [41] [42] [43]
Фактор, полученный из пигментного эпителия ( PEDF ), также действует как ингибитор ангиогенеза . Секреция PEDF заметно снижается в условиях гипоксии, что позволяет доминировать эндотелиальной митогенной активности VEGF, что позволяет предположить, что потеря PEDF играет центральную роль в развитии NV, вызванного ишемией . Одно клиническое открытие показывает, что уровни PEDF в водянистой влаге человека снижаются с возрастом, что указывает на то, что снижение может привести к развитию AMD. [29] [44] В модели на животных AAV с человеческой кДНК PEDF под контролем промотора CMV предотвращал хориоидальный и ретинальный NV. [45]
Результаты исследования показывают, что экспрессия ангиостатических факторов, опосредованная AAV, может быть использована для лечения NV. [46] [47] Этот подход может быть полезен в качестве альтернативы частым инъекциям рекомбинантного белка в глаз. Кроме того, PEDF и sFlt-1 могут диффундировать через ткань склеры , [48] что позволяет потенциально быть относительно независимым от места внутриглазного введения.
{{cite journal}}
: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )